Разработка ядерных микросателлитных маркеров сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) по данным полногеномного секвенирования




Дата канвертавання25.04.2016
Памер37.97 Kb.
РАЗРАБОТКА ЯДЕРНЫХ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ (Pinus sibirica Du Tour) ПО ДАННЫМ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Белоконь М.М.1, Полякова Т.А.1, Шатохина А.В.1, Мудрик Е.А.1, Белоконь Ю.С.1,
Путинцева Ю.А.2, Орешкова Н.В. 2,3, Политов Д.В.1, Крутовский К.В. 1,2,4,5

1Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, Россия, belokon@vigg.ru;

2Сибирский федеральный университет, Красноярск, Россия;

3Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск, Россия;

4Гёттингенский университет им. Георга-Августа, Гёттинген, Германия;

5Техасский университет A&M, Колледж-Стейшен, Техас, США
Геномные исследования хвойных древесных растений с применением методов секвенирования нового поколения (т.н. Next-Generation Sequencing), помимо новых широких возможностей для повышения уровня фундаментальных исследований дают непосредственные множественные выгоды для практических применений молекулярных биотехнологий. Одним из подобных применений является молекулярно-генетическое маркирование с помощью методов, основанных на ДНК-анализе для целей идентификации, изучения популяционно-генетической структуры, гибридизации и т. д., что особенно актуально в случае древесных растений, у которых получение генетической информации на основе фенотипа осложняется модифицирующим действием окружающей среды и большой длительностью поколения. Ядерные микросателлитные локусы, благодаря специфичности, кодоминантности и высокому уровню полиморфизма являются ценным инструментом для генетического анализа на популяционном и индивидуальном уровнях. Однако для одного из важнейших в экономическом и экологическом отношениях лесообразующих хвойных видов России – сибирской кедровой сосны, Pinus sibirica Du Tour - специфических микросателлитных праймеров до сих пор разработано не было. Разработка праймеров проводилась в Лаборатории лесной геномики Научно-образовательного центра геномных исследований Сибирского федерального университета (http://genome.sfu-kras.ru/forest_genomics) на основании контигов, полученных при полногеномном анализе сибирской кедровой сосны и содержащих короткие тандемные повторы (повторяющиеся мотивы из 3-6 пар нуклеотидов). Для тестирования использовали образцы ДНК индивидуальных деревьев сибирской кедровой сосны из 14 выборок, представляющих большую часть видового ареала. Схема тестирования включала первичное тестирование ПЦР праймеров на образцах ДНК от четырех деревьев. После оптимизации условий амплификации генотипировали 8 деревьев из одной популяции с целью выявления полиморфизма. Локусы, которые оказались мономорфными в одной выборке, тестировали на девяти деревьях из девяти географически отдаленных популяций. В случае выявления полиморфизма тестирование проводили с использованием материала из нескольких популяций (по 10-12 деревьев из каждой). На первом этапе были протестированы 40 пар праймеров для локусов, у которых в контигах содержалось не менее пяти повторов. Анализ показал в трех случаях отсутствие ПЦР продукта, в двух – неспецифичную амплификацию. В то время как 29 из 35 локусов устойчиво амплифицировались и были протестированы на образцах из различных популяций. Однако уровень полиморфизма по ним был очень низок – от двух до четырех аллелей на локус. Общим результатом тестирования первой серии праймеров было установление факта высокоспецифичной амплификации при низком уровне полиморфизма. Новая серия праймеров была разработана на основе контигов, содержащих от 10 до 16 коротких тандемных повторов. Из 30 пар праймеров три обнаружили отсутствие ПЦР продукта, семь – неспецифичную амплификацию. Для трех локусов наблюдались множественные продукты амплификации, что затрудняло интерпретацию спектров изменчивости. Еще два локуса оказались полиморфными, но с явным присутствием «нуль-аллелей». Среди 14 локусов с устойчивой амплификацией и интерпретируемыми паттернами один локус оказался мономорфным, а остальные локусы были полиморфными, при этом наиболее простые спектры с одной зоной, числом аллелей от двух до семи и ожидаемой гетерозиготностью от 0,2 до 0,875 показали восемь локусов. В целом, в данной серии получен меньший процент локусов со специфической амплификацией, но гораздо более высокий выход полиморфных локусов по отношению к общему тестируемому набору. Таким образом, по результатам тестирования из 70 микросателлитных локусов с три-, тетра- и пентануклеотидными повторами отобрано 20 перспективных средне- и высокополиморфных локусов, которые можно использовать как генетические маркеры в популяционно-генетических исследованиях сибирской кедровой сосны.

Работа выполнена в рамках проекта «Геномные исследования основных бореальных лесообразующих хвойных видов и их наиболее опасных патогенов в Российской Федерации», финансируемого Правительством РФ (договор № 14.Y26.31.0004).
DEVELOPING NUCLEAR MICROSATELLITE MARKERS IN SIBERIAN STONE PINE (Pinus sibirica Du Tour) USING WHOLE GENOME SEQUENCING DATA

Belokon M.M.1, Polyakova T.A.1, Shatokhina A.V.1, Mudrik E.A.1, Belokon Yu.S.1,
Putintseva Yu.A.2, Oreshkova N.V. 2,3, Politov D.V.1, Krutovsky K.V. 1,2,4,5

1N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Science, Moscow, Russia, belokon@vigg.ru;

2Siberian Federal University, Krasnoyarsk, Russia;

3V.N. Sukachev Institute of Forest, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Krasnoyarsk, Russia;

4Georg-August University of Göttingen, Göttingen, Germany;

5Texas A&M University, College Station, Texas, USA
Genomic research in conifers using Next-Generation Sequencing (NGS) methods is not only broadening fundamental knowledge, but also provides new tools and direct benefits for practical applications in forestry. Molecular genetic DNA markers are among such tools that can be used for individual identification and to study population genetic structure. These tools are especially useful for forest trees, where obtaining genetic information is hampered by modifying environmental effects and long generation time. Due to their advantageous properties such as specificity, high variability, and co-dominance, nuclear microsatellites represent very useful markers for genetic analysis at both population and individual levels. However, specific microsatellite markers have not been developed yet for Siberian stone pine (Pinus sibirica Du Tour), one of the most economically and ecologically important forest-forming conifer species in Russia. Several sets of new PCR primers have been designed at the Laboratory of Forest Genomics in Genome Research and Education Center of Siberian Federal University (http://genome.sfu-kras.ru/en/forest_genomics) based on contigs obtained in the whole genome sequencing of Siberian stone pine and containing short tandem repeats (3-6 bp long motifs). DNA isolated from trees representing 14 range-wide population samples of P. sibirica was used for primer testing. The initial testing was done using DNA from four individuals. After the optimization of PCR conditions the further testing was done using DNA samples of 8 trees from one population in order to detect polymorphism. Loci that were monomorphic at this testing phase were additionally screened using DNA of 9 trees from 9 different geographically remote populations. In cases where polymorphism has been revealed testing was performed with trees from several populations (10-12 trees each). The first set of 40 pairs of oligonucleotide primers was derived from contigs with microsatellite loci containing no less than 5-9 repeat motifs. Among these loci three gave no PCR product, and two showed unspecific amplification, while other 29 out of 35 loci had consistent amplification and have been tested in different trees. However, a relatively low level of polymorphism was detected for them (2-4 alleles per locus). The first set of primers demonstrated high specificity of amplification, but relatively low polymorphism. The second set of primers was designed based on contigs containing higher number (10-16) of short tandem repeats. Out of 30 primer pairs, three showed no PCR product and seven were amplified inconsistently. For three other primer pairs multiple amplification products were observed that complicated their interpretation and genotyping. Two more loci were polymorphic but contained 'null-alleles'. Among 14 consistently amplified and reliably interpreted loci one was monomorphic while out of the rest 13 polymorphic loci only 8 demonstrated clear single locus amplification patterns with 2-7 alleles and expected heterozygozity varying from 0.2 to 0.875. This primer set provided lower proportion of loci with specific amplification but higher number of polymorphic loci. Thus, in total from the tested 70 primer pairs 20 can be used to reliably genotype microsatellite loci with moderate to high level of polymorphism. These loci can be used as genetic markers in population genetic studies of Siberian stone pine and other applications.

The presented study was a part of the project "Genomic studies major boreal coniferous forest tree species and their most dangerous pathogens in the Russian Federation" funded by the Government of the Russian Federation (contract № 14.Y26.31.0004).


База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка