Purificación de dos isoenzimas de polifenoloxidasa del mamey




Дата канвертавання25.04.2016
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PURIFICACIÓN DE DOS ISOENZIMAS DE POLIFENOLOXIDASA DEL MAMEY (Pouteria sapota)
Palma – Orozco, G(1)., Ortiz – Moreno, A(1)., Dorantes – Álvarez, L(1)., Nájera, H(2).
(1)Departamento de Ingeniería Bioquímica, ENCB – IPN, México D.F. gisepalma@hotmail.com

(2)Departamento de Ciencias Naturales, UAM – Cuajimalpa, México D.F. hnajerap@gmail.com

RESUMEN

El mamey es un fruto de clima tropical, su cosecha se lleva a cabo cuando está inmaduro, mantienen buena calidad para el consumo por aproximadamente cinco días. Para evaluar la calidad durante varias etapas de desarrollo del fruto, las enzimas son utilizadas como indicadores biológicos, ya que su actividad depende de la fisiología del tejido. La estructura se modifica cuando son manipuladas. La polifenoloxidasa (PFO) es una enzima que provoca el oscurecimiento afectando la calidad en el tejido en frutos y vegetales. La actividad de la PFO se midió utilizando catecol como sustrato, a 420 nm. En la purificación por cromatografía de intercambio iónico, se presentaron dos diferentes comportamientos de la enzima, la PFO 1 que se presentó antes del inicio del gradiente y la PFO 2 en el gradiente, lo cual indica que se trata de dos isoenzimas presentes en el mamey. La PFO 2 fue inestable por lo que se inactivó en un tiempo de 24 h. Los inhibidores más efectivos para la PFO 1 fueron el ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, el pH óptimo se detectó entre 7.0 y 7.5. Se determinó la constante de Michaelis – Menten (Km) 44 mM y la velocidad máxima (Vmax) 1696 U/mg prot  min, utilizando como sustrato al catecol.


1. INTRODUCCIÓN

Los frutos del mamey son bayas de hasta 20 cm de largo, ovoides, morenos rojizos y de textura áspera, su cáscara representa alrededor del 10% (Figura 1). El mesocarpio es dulce, carnoso, de color naranja a rojo, o color rosa salmón y representa casi un 78%, con pequeñas cantidades de látex cuando está inmaduro. El fruto contiene generalmente una semilla (ocasionalmente 2 y con menor frecuencia 3) de hasta 10 cm de largo representando del 12 al 20% del peso total, con la consecuente reducción de la pulpa (5).





Figura 1. Mamey (Pouteria sapota)

Este fruto de clima tropical es cortado cuando esta inmaduro, tarda aproximadamente cinco días para madurar a una temperatura de 30 a 35°C. Durante el desarrollo del fruto después de la cosecha, que incluye las etapas de preclimaterio, climaterio y postclimaterio, las enzimas juegan un papel importante ya que cambian de actividad y/o son alteradas estructuralmente por lo que provocan cambios en el tejido (2). La PFO es una enzima que afecta la calidad en el tejido en frutos y vegetales, provoca el oscurecimiento debido a heridas o golpes, o durante la fruta a procesar. Esta enzima contiene cobre como grupo prostético, la cual cataliza dos diferentes tipos de reacciones, ambas involucran compuestos fenólicos. Estas reacciones involucran la hidroxilación de monofenoles para dar o-difenoles y la eliminación de hidrógenos del o-difenol para dar una o-quinona. Las quinonas son moléculas altamente electrofílicas que se pueden polimerizar permitiendo la formación de pigmentos oscuros (4).

El objetivo de este trabajo fue purificar y caracterizar la polifenoloxidasa del mamey en estado de madurez de consumo.
2. MATERIALES Y MÉTODOS

La PFO se extrajo con solución amortiguadora de fosfato de sodio 0.2 M pH 7.0, polivinilpirrolidona al 1%, Triton X-100 al 1%, e inhibidores de proteasas: aprotinina y fenilmetilsulfonilfloruro (PMSF). Se precipitó diferencialmente con sulfato de amonio (NH4)2SO4 (0-30%, 30-85%).La purificación se llevó a cabo por cromatografía de hidrofobicidad e intercambio iónico. La actividad de la PFO se midió utilizando catecol 50mM como sustrato disuelto en amortiguador de fosfato de sodio 0.2M pH 7.0, a 420 nm. Se realizó el efecto de inhibidores, pH, se determinaron los parámetros cinéticos Km y Vmax. La pureza de la enzima se determinó usando electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS – PAGE) (3).
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Durante la extracción de la PFO es esencial minimizar la fenoloxidación, lo cual puede resultar en la pérdida de actividad debido a la reacción de las quinonas con la enzima (6). La actividad de la PFO en el extracto crudo fue de 570 U/mg prot  min. En la Figura 2, se muestra el perfil de elución por cromatografía de hidrofobicidad en donde se observan diferentes fracciones que presentaron actividad de la PFO, las fracciones con mayor concentración de proteína y actividad se juntaron. Posteriormente se pasaron a una cromatografía de intercambio iónico.





Figura 2. Perfil de elución por cromatografía de hidrofobicidad

En la cromatografía de intercambio iónico (Figura 3), se presentaron dos regiones en donde se detectó actividad de polifenoloxidasa, una se presentó antes del inicio del gradiente (PFO 1) con una actividad de 933 U/mg prot  min y la otra en el gradiente (PFO 2) con una actividad de 3648 U/mg prot  min, lo cual sugiere la presencia de dos isoenzimas presentes en el mamey.





Figura 3. Perfil de elución por cromatografía de intercambio iónico

Para la identificación de las dos isoenzimas se llevó a cabo la determinación del peso molecular realizando una electroforesis en donde se observó que la PFO 1 fue de 25 kDa y para la PFO 2 fue de 20 kDa (Figura 4).




Figura 4. Electroforesis en gel de las dos isoenzimas de la PFO: (1) PFO 1, (2) PFO 2, (3) marcadores de peso molecular

La enzima PFO 2 fue inestable por lo que se inactivó en 24 h. En la PFO 1 se realizó el efecto de inhibidores, donde la actividad se midió en presencia de ocho inhibidores distintos utilizando ácido ascórbico, cloruro de sodio, metabisulfito de sodio, ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido succínico, ácido benzoico y sorbato de potasio; a tres diferentes concentraciones: 0.1 mM, 1 mM, 10 mM. Los inhibidores más efectivos fueron el ácido ascórbico en las concentraciones de 1 mM y 10 mM y el metabisulfito de sodio en las tres concentraciones.


Para el efecto de pH se utilizó el catecol disuelto en un amortiguador de ácido cítrico 0.1 M – fosfato de sodio 0.2 M, en un intervalo de pH 2.5 a pH 9.0; y se encontró que para la PFO 1 el pH óptimo fue entre 7.0 y 7.5 con una actividad de 1076 U/mg prot  min y 986 U/mg prot  min, respectivamente (Figura 5).




Figura 5. Efecto de pH
Con respecto al efecto de temperatura, la enzima se incubó de 20 °C a 70°C, y la actividad enzimática se midió después de 30 min. La temperatura óptima se presentó a 35°C, con una actividad de 2655 U/mg prot  min, (Figura 6).


Figura 6. Efecto de temperatura
Se realizó una cinética enzimática para determinar los parámetros Km y Vmax utilizando catecol como sustrato a diferentes concentraciones (de 0 a 140 mM). En la Figura 7, se muestran los valores obtenidos, en donde se presentó una Km de 44 mM y Vmax de 1696 U/mg prot  min.



Figura 7. Cinética enzimática


4. CONCLUSIONES

Se ha purificado y caracterizado la PFO en diferentes frutos y vegetales, donde se han encontrado distintas isoenzimas. En la purificación de la PFO del mamey en estado de madurez de consumo se presentaron dos isoenzimas, donde la PFO 1 fue más estable que la PFO 2 ya que ésta enzima se inactivó. El pH óptimo de PFO 1 se presentó a pH 7.0, y su temperatura óptima a 35°C. El inhibidor más significativo para la PFO 1 fue el metabisulfito de sodio, y presentó una Km de 44 mM utilizando catecol como sustrato.



También se ha determinado la constante cinética (Km) de distintos frutos y vegetales, y se ha encontrado que la PFO es diferente de cada vegetal ya que presentan afinidad hacia distintos sustratos, tal como la PFO de la papa que presentó una afinidad hacia el ácido clorogénico con una Km de 0.9 mM (7), la PFO de la calabaza tuvo afinidad con el pirogalol obteniendo una Km de 15.4 mM (8), y para la PFO del plátano la Km fue de 2.7 mM con el sustrato dopamina (1).

5. BIBLIOGRAFÍA

  1. Chang-Peng Y., Shuji, F., Koei, K., Akiko, K., MD. Ashrafuzzaman, and Nobuyuki, H. (2001). Partial purification and characterization of polyphenoloxidase from Banana (Musa sapientum L.) peel. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1446-1449.

  2. Nava, Cruz Yolanda., y Ricker, Martín., (2004). Cápitulo 3. El zapote mamey [Pouteria sapota (Jaq.) H. Moore y Stearn], un fruto de la selva mexicana con alto valor comercial. Productos Forestales, Medios de Subsistencia y Conservación. Estudios de Caso sobre Sistemas de Manejo de Productos Forestales No Maderables. Vol. 3, América Látina. Edit. Miguel N. Alexiades y Patricia Shanley. pp:43 – 62.

  3. Ni Eidhin, Deirdre M., Murphy E., O’Beirne, D., (2006). Polyphenol oxidase from apple (Malus domestica Borkh. cv Bramley’s Seedling): Purification Strategies and Characterization. J Food Sci. 71(1):C51 – C58.

  4. Mayer, A.M., Harel, E., (1991). Phenoloxidases and their significance in fruit and vegetables. In Fox, P.F. (Ed), Food Enzymology, Vol, 1. Elsevier, New York, pp: 373 – 398.

  5. Pennington, T. D., y Sarukhán, J., (1998). Árboles tropicales de México. Universidad Nacional Autónoma de México y Fondo de Cultura Económica, México D.F, pp: 521.

  6. Rocha, AMCN., and Morais AMMB., (2001). Characterization of polyphenoloxidase (PPO) extracted from ‘Jonagored’ apple. Food Control 12:85 – 90.

  7. Sánchez, F.A., Laveda, F., García, C.F., (1995). Partial purification of soluble potato polyphenoloxidase by artitioning in an aqueous two-phase system. J. Agrlc. Food Chem, 41, 1219-1224.

  8. Takeshi, N and Nobutaka S., (2001). Partial purification of polyphenoloxidase from Chinese cabbage (Brassica rapa L.). J. Agric. Food Chem., 49, 3922-3926.





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