Nicotiana




Дата канвертавання24.04.2016
Памер245.57 Kb.


На правах рукописи

САНГАЕВ СОДНОМ СЕРГЕЕВИЧ
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ НА МОДЕЛИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА (NICOTIANA TABACUM L.)
03.02.07 - генетика
Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2010

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.


Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Кочетов А. В.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Першина Л.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск


доктор биологических наук, профессор

Беклемишев А.Б.

Институт биохимии СО РАМН,

г. Новосибирск


Ведущее учреждение: Биолого-почвенный институт

Дальневосточного отделения РАН,

г. Владивосток

Защита диссертации состоится «__» ________ 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.


Автореферат разослан «__» __________2010 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Функции экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз растений в настоящее время малоизучены. Известно, что экспрессия генов некоторых экстраклеточных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, при фосфатном голодании, в стареющих тканях растений, а также при инфекции.

Предполагают, что одна из функций этих ферментов может быть связана с механизмами неспецифической защиты от патогенов вирусной и грибковой природы (Galiana et al., 1997; Hugot et al., 2002; LeBrasseur et al., 2002). Это предположение основано, в частности, на том, что экспрессия некоторых генов S-подобных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, причем не только локально (в месте повреждения), но и системно (Ye and Droste, 1996; Lers et al., 1998; LeBrasseur et al., 2002). Для многих вирусов покровные ткани растения являются труднопреодолимым барьером, и поранение, вызванное механическим повреждением, позволяет им проникнуть в растение. Принимая во внимание тот факт, что у большинства вирусов растений генетический материал представлен РНК, можно предположить, что экстраклеточные РНКазы, индуцируемые поранением, являются одним из компонентов противовирусной защиты на начальных этапах инфекции. Однако причины повышения РНКазной активности и функциональная роль индуцированных РНКаз именно в вирусоустойчивости пока остаются неясными. Так, индукция рибонуклеаз может быть вызвана собственно повреждением тканей или их преждевременным старением и отмиранием и может быть необходима для ремобилизации фосфата (Green, 1994).

С другой стороны, в некоторых тестах in vitro и in planta показана противогрибковая активность экстраклеточной РНКазы табака (Hugot et al., 2002). Данных о противовирусной активности экстраклеточных РНКаз растений нет, однако показано, что экзогенное нанесение панкреатической РНКазы быка (РНКазы А) вместе с вирусным инокулюмом защищает растения от вируса табачной мозаики (ВТМ) (Galiana et al., 1997). Кроме того, трансгенные растения табака, экспрессирующие РНКазу А быка, характеризуются повышенной устойчивостью к ВТМ (Trifonova et al., 2007). Эти результаты не означают, что растительные рибонуклеазы также обладают противовирусной активностью, поскольку наблюдаемый эффект может быть связан со специфическими свойствами РНКазы А. Однако участие рибонуклеаз растительного происхождения в механизмах вирусоустойчивости весьма вероятно.

По-видимому, S-подобные рибонуклеазы растений могут выполнять и другие, не известные в настоящее время функции. Для некоторых экстраклеточных РНКаз показана экспрессия на ранних стадиях развития (Rogers and Rogers, 1999; Köck et al., 2004; Hillwig et al., 2008). Это дает основания полагать, что некоторые S-подобные РНКазы участвуют в контроле процессов роста и развития.

В целом, имеющиеся данные указывают на то, что S-подобные РНКазы могут быть задействованы в ряде важных биологических процессов (прорастание, развитие, ремобилизация фосфата, стрессоустойчивость, формирование устойчивости к патогенам – особый интерес представляет возможное участие РНКаз в формировании неспецифической вирусоустойчивости). Большая часть из этих функций пока остаются недоказанными, что обусловливает актуальность проведения исследований в этом направлении.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в создании трансгенных растений табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз и исследовании на этой модели функциональной роли экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к патогенам, а также в процессах роста и развития.

Были поставлены следующие задачи:



  1. создание генетических конструкций, обеспечивающих повышенный и сниженный уровень рибонуклеазной активности в апопласте;

  2. получение трансгенных растений табака с увеличенным и сниженным уровнем рибонуклеазной активности в апопласте;

  3. анализ вирусоустойчивости трансгенных и контрольных растений;

  4. сравнительный анализ трансгенных и контрольных растений табака по морфологии и срокам развития.

Научная новизна. Создана новая генетическая модель – трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз (увеличенной и сниженной по сравнению с контролем). Показано, что в нормальных условиях трансгенные растения не проявляют значимых отличий от растений исходной линии по морфологическим параметрам. Впервые показано, что повышенный уровень РНКазной активности в апопласте вследствие конститутивной экспрессии РНКазы ZRNaseII Zinnia elegans сопровождается повышенной вирусоустойчивостью растений, что подтверждает гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании вирусоустойчивости. Кроме того, результаты анализа полученных модельных растений позволяют предположить, что в нормальных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не влияет на процессы роста и развития растений.

Практическая ценность. Показано, что экстраклеточные рибонуклеазы растений могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с повышенной вирусоустойчивостью. Получен патент: Заявка 2009109530 Российская федерация. МПК C12N15/82. Рекомбинантная плазмида, обеспечивающая экспрессию гена экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans ZRNaseII в трансгенных растениях (варианты) и способ получения вирусоустойчивых форм растений. / Авторы: Трифонова Е.А., Сангаев С.С., Романова А.В., Кочетов А.В., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И, Шумный В.К.; заявитель: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ СО РАН); приоритет 16.03.2009. решение о выдаче патента от 04.02.2010.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Генетическая конструкция pBi-Nk, несущая двуцепочечный РНК-супрессор гена экстраклеточной РНКазы Nk1 Nicotiana tabacum, обеспечивает существенное снижение активности РНКазы Nk1.

  2. Генетическая конструкция pBi-RNS, несущая кДНК экстраклеточной РНКазы ZRNaseII Zinnia elegans под управлением промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, обеспечивает эффективную экспрессию РНКазы ZRNaseII и существенное увеличение общей рибонуклеазной активности в апопласте табака.

  3. Трансгенные растения, конститутивно экспрессирующие РНКазу ZRNaseII, характеризуются повышенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики.

  4. Трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз не проявляют существенных отличий от растений исходной линии по морфологическим характеристикам и параметрам развития.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007 г.); на Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007 г.); на Международной научной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2008 г); на Российско - Французской конференции “Problems and prospects in plant biotechnology” (Новосибирск, 2008 г.); на Германо - Российском биотехнологическом форуме (Новосибирск, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы в рецензируемых журналах и получен 1 патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 22 рисунка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Для получения кДНК гена ZRNaseII использовались растения циннии Zinnia elegans. Для получения кДНК гена Nk1 и для получения трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. в качестве исходного материала была использована линия табака (N. tabacum) SR1 (2n=48).

Бактериальные штаммы. Для генно-инженерных работ использовали штамм Escherichia coli XL-1 Blue. Для трансформации растений использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0.

Плазмиды. При создании генетических конструкций использовались плазмиды pBluescript II SK (Fermentas) и pRT104 (Topfer et al., 1987), а также бинарные векторы для трансформации растений pBi101 и pBi121 (Jefferson, 1989).

Получение генетических конструкций. Для получения генетических конструкций использовали стандартные методы молекулярного клонирования (Маниатис и др., 1984).

Получение трансгенных растений табака. Трансформацию растений табака проводили путем кокультивирования листовых дисков с A. tumefaciens. Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS (Murashige and Scoog, 1962) с добавлением соответствующих растительных гормонов и селектирующего агента (канамицина). Для проведения экспериментов трансформанты размножали с помощью микроклонирования. Семена трансгенных растений поколения Т1 получали путем самоопыления трансформантов. Семена поколения Т2 получали с помощью самоопыления растений поколения Т1, устойчивых к канамицину.

Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из листьев контрольных и трансгенных растений с использованием набора Genomic DNA purification kit (Fermentas). 15 мкг выделенной геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HindIII, фракционировали в 0.75% агарозном геле и переносили на заряженную нейлоновую мембрану капиллярным способом. В качестве зонда использовался фрагмент Т-ДНК конструкции, использованной для трансформации.

Получение белковых экстрактов. В работе использовались грубые листовые экстракты и смывы апопластной жидкости. Грубые листовые экстракты получали согласно (Blank and McKeon, 1989) из пробирочных растений 4-6 недельного возраста, выращенных в стандартных условиях. Смывы апопластной жидкости получали по методике (Сапоцкий и др., 2001) из растений 8-12-недельного возраста, выращенных в условиях теплицы. В полученных белковых экстрактах и смывах апопластной жидкости определяли концентрацию суммарного растворимого белка по Брэдфорду (Bradford, 1976) и использовали их для дальнейших экспериментов.

Измерение уровня рибонуклеазной активности в белковых экстрактах производили путем измерения изменения количества кислоторастворимого материала в суммарной РНК дрожжей (Blank and McKeon, 1989). На каждую реакцию брали объем экстракта, содержащий 25 мкг суммарного растворимого белка.

Анализ спектра белков с рибонуклеазной активностью в белковых экстрактах из листьев первичных трансформантов и контрольных растений табака проводили по методике (Yen and Green, 1991) с модификациями. Аликвоты, содержащие 25 мкг суммарного растворимого белка, смешивали с буфером для нанесения белков, инкубировали при 950С в течение 3 минут и проводили электрофорез в денатурирующих условиях, используя полиакриламидный гель с добавлением в состав разделяющего геля суммарной РНК дрожжей в концентрации 2 мг/мл. После электрофореза гель отмывали от SDS для ренатурации белков, инкубировали в буфере для ферментативной деградации субстрата, отмывали и окрашивали в растворе толуидинового голубого О. Окрашенный гель отмывали, при этом на синем фоне белки с РНКазной активностью проявлялись белыми полосами, интенсивность которых зависела от активности (в данных условиях) и количества белка.

Определение содержания вирусного антигена в листовых экстрактах проводили согласно (Сапоцкий и др., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создание генетических конструкций. В данной работе нас интересовали экстраклеточные РНКазы, индуцируемые при поранении, в связи с их возможной ролью в формировании устойчивости к вирусам. Согласно литературным данным, для генов РНКаз ZRNaseII Zinnia elegans и Nk1 Nicotiana tabacum характерна индукция экспрессии в ответ на поранение (Ye and Droste, 1996; Ohno and Ehara, 2005). Кроме того, для гена РНКазы Nk1 N. tabacum показана индукция в ответ на вирусную инфекцию.

Для получения растений табака с измененной активностью экстраклеточных РНКаз были получены две генетические конструкции на базе бинарных векторов pBi101 и pBi121 для трансформации растений (Jefferson, 1989) (рис. 1). Конструкция pBi-RNS содержит белок-кодирующую последовательность гена РНКазы ZRNaseII Zinnia elegans под управлением промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Конструкция pBi-Nk содержит двуцепочечный РНК-супрессор гена экстраклеточной РНКазы Nk1 Nicotiana tabacum. Мы называем этот супрессор «двуцепочечным», потому что он содержит фрагменты кДНК РНКазы Nk1 в виде инвертированного повтора (Nk-s и Nk-as). При экспрессии такой конструкции синтезированная РНК будет самокомплементарна и сможет образовывать протяженный двуцепочечный участок. Согласно литературным данным, использование двуцепочечного супрессора эффективнее использования антисмыслового супрессора для подавления активности генов (Wang and Waterhouse, 2000).




А

Б


Рисунок 1. Области Т-ДНК полученных генетических конструкций (А – pBi-RNS; Б – pBi-Nk): ZRNaseII – белок-кодирующая последовательность гена ZRNaseII Zinnia elegans; Nk-s Nk-as – смысловой и антисмысловой фрагменты кДНК РНКазы Nk1 Nicotiana tabacum; 35S CaMV promoter – промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; NPTII – ген неомицинфосфотрансферазы II E. coli, CaMV polyA-signal, NoS Ter – сигналы полиаденилирования; NoS Pro – промотор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens; RB и LB – повторы, ограничивающие область Т-ДНК.

Получение трансформантов табака и подтверждение наличия генетической конструкции в геноме. Полученными конструкциями трансформировали компетентные клетки A. tumefaciens методом прямой трансформации. Трансформация N. tabacum была проведена методом агробактериальной трансфекции листовых дисков. Были получены 24 независимых трансформанта табака, несущих конструкцию pBi-RNS, и 35 независимых трансформантов табака, несущих конструкцию pBi-Nk.

Первичный скрининг и отбор трансформантов проводили, измеряя суммарную РНКазную активность в белковых экстрактах с помощью пробирочных тестов (Blank and McKeon, 1989). Прямой отбор растений с желаемым уровнем РНКазной активности позволил не проводить молекулярно-генетический анализ всех трансформантов. Тем не менее, у ряда трансформантов наличие полной встройки трансгена было подтверждено с помощью ПЦР, а также с помощью Саузерн-блот гибридизации (рис. 2).




А



Б



Рисунок 2. Доказательство присутствия трансгенных конструкций в геноме полученных трансформантов:

А. Электрофореграмма ПЦР со специфическими праймерами на белок-кодирующую часть гена РНКазы ZRNaseII с геномной ДНК трансформантов табака, несущих конструкцию pBi-RNS (№1, №2, №5, №10). В качестве положительного контроля использовалась плазмида pBi-RNS, в качестве отрицательного - ДНК нетрансгенного растения табака линии SR1.

Б. Саузерн-блот гибридизация: 1, 4 – геномная ДНК нетрансгенных растений исходной линии SR1 (контроль); 2, 3, 5, 6 – геномная ДНК трансформантов, несущих конструкцию pBi-Nk (Nk11, Nk8, Nk4 и Nk2, соответственно). В качестве зонда использовался участок Т-ДНК, содержащий ген неомицинфосфотрансферазы (nptII) и терминатор из гена нопалинсинтазы (NoS Ter).



Рибонуклеазная активность и спектр белков с РНКазной активностью у трансформантов. Уровень РНКазной активности определяли как в грубых листовых экстрактах, содержащих белки различной локализации (внутриклеточные и экстраклеточные), так и в смывах апопластной жидкости, содержащих преимущественно экстраклеточные белки. Апопласт, или свободное пространство - это часть внеклеточного объема ткани, содержимое которой может легко обмениваться с внутриклеточным содержимым (Чиков, 1998).

Трансформанты табака, несущие РНКазу ZRNaseII, характеризуются высоким уровнем РНКазной активности в грубых экстрактах (рис. 3А) и в смывах апопластной жидкости (рис. 3Б). При этом в спектре белков с РНКазной активностью (рис. 4А) имеются два дополнительных сигнала, интенсивность которых коррелирует с уровнем РНКазной активности (рис. 4Б). Эти результаты показывают, что в трансформантах табака РНКаза ZRNaseII Zinnia elegans эффективно экспрессируется и локализована в апопласте.

Были отобраны трансформанты №1, №2, №5, №10, №16 и №23, условно подразделенные на 3 группы по уровню экспрессии трансгенной РНКазы - высокий (№1 и №2), средний (№5 и №10) и низкий (№16 и №23). В серии измерений уровень рибонуклеазной активности у отобранных трансформантов был определен точнее. Результаты этих измерений приведены в таблице на рисунке 4В. У отобранных трансформантов рибонуклеазная активность в грубых листовых экстрактах в 5-15 раз превышает таковую у нетрансгенных растений.

У трансформантов табака, несущих двуцепочечный супрессор РНКазы Nk1, уровень РНКазной активности в апопласте приблизительно в два раза ниже, чем у контрольных растений (рис. 5А). Анализ спектра белков с рибонуклеазной активностью у трансформантов показал, что у этих растений отсутствует или значительно снижена активность одной из РНКаз (рис. 5Б).


А

Б




Рисунок 3. РНКазная активность в грубых листовых экстрактах (А) и в смывах апопластной жидкости (Б) у трансформантов, несущих конструкцию pBi-RNS. На рисунке А приведен первичный скрининг трансформантов. Кружками выделены отобранные трансформанты. На рисунке Б - анализ ряда отобранных трансформантов. В качестве контроля использовались нетрансгенные растения табака линии SR1.




Рисунок 4. А. Спектр белков с рибонуклеазной активностью в грубых экстрактах трансформантов №1 и №5, несущих РНКазу ZRNaseII Z. elegans (стрелками указаны сигналы, соответствующие трансгенной РНКазе). Б, В. Рибонуклеазная активность в грубых листовых экстрактах трансформантов, экспрессирующих РНКазу ZRNaseII Z. elegans. В качестве контроля использовались нетрансгенные растения табака линии SR1.

А



Б


Рисунок 5. А. Рибонуклеазная активность в смывах апопластной жидкости трансформантов табака, несущих конструкцию pBi-Nk. Б. Анализ спектра белков с рибонуклеазной активностью в грубых экстрактах трансформантов табака, несущих супрессор Nk1 Nicotiana tabacum. В качестве контроля использовались нетрансгенное растение табака SR1 и трансформант, экспрессирующий РНКазу циннии ZRNaseII (RNS5).



Рисунок 6. Сравнение спектра белков с рибонуклеазной активностью в грубых экстрактах растений табака при pH 6.0 и pH 7.0. На каждую дорожку нанесено по 25 мкг суммарного растворимого белка. Использовались нетрансгенное растение табака (SR1), трансформант, несущий супрессор гена Nk1 (Nk11), и трансформант, экспрессирующий РНКазу циннии ZRNaseII (RNS5).
РНКаза, инактивируемая у растений, несущих супрессор гена Nk1, в норме (у нетрансгенного растения табака линии SR1) выделяется на фоне остальных РНКаз своей довольно высокой активностью при pH 6.0, однако не детектируется при pH 7.0 (рис. 6). Такая зависимость ферментативной активности от pH характерна для других экстраклеточных S-подобных РНКаз (Yen and Green, 1991; Kariu et al., 1998; Okabe et al., 2005).

В целом, результаты анализа РНКазной активности в апопласте и спектра белков с РНКазной активностью в грубых экстрактах растений табака, несущих двуцепочечный супрессор РНКазы Nk1, показывают, что у этих растений происходит эффективное снижение активности этой РНКазы.


Стабильность экспрессии трансгенных конструкций в поколениях.

Стабильность экспрессии трансгенных конструкций в поколениях оценивали с помощью анализа наследования маркерного гена nptII, обеспечивающего устойчивость к канамицину (у растений табака, не имеющих к нему устойчивости, развивается хлороз). Семена, полученные от самоопыления трансформантов, высаживали на среду MS с добавлением канамицина (200 мг/л). Если в геноме трансформанта (поколение Т0) имеется единичная инсерция гена nptII, то соотношение между числами зеленых и хлоротичных проростков (поколение Т1) должно составлять 3 : 1. Соответственно, двум копиям трансгена должно соответствовать соотношение 15 : 1. Однако если имеет место генетический сайленсинг, то наблюдаемое соотношение будет отличаться от стандартного.

Потомки (поколение Т1) двух из пяти взятых для анализа трансформантов, несущих конструкцию pBi-RNS, проявляли замолкание экспрессии маркерного гена. Такая высокая степень замолкания, по-видимому, объясняется применением сильного конститутивного промотора вирусной природы (промотор 35S РНК ВМЦК), а также, возможно, наличием нескольких инсерций трансгенной конструкции (Arciello et al., 2003). Потомки трансформантов №1 и №5 характеризуются стабильной экспрессией nptII как минимум в двух поколениях (Т1 и Т2). При этом согласно результатам сегрегационного анализа, эти трансформанты несут единичную инсерцию генетической конструкции. Наблюдаемая стабильность экспрессии единичных инсерций Т-ДНК (несущих кодирующие последовательности ДНК в смысловой ориентации) согласуется с литературными данными (Arciello et al., 2003).

Анализ стабильности экспрессии гена nptII в конструкции pBi-Nk в поколении Т1 показал, что в большинстве случаев также наблюдается та или иная степень замолкания маркерного гена. Такое замолкание является вполне закономерным при применении двуцепочечных РНК-супрессоров, так как часто происходит генетический сайленсинг не только гена-мишени, но и конструкции, обеспечивающей его индукцию. Этот феномен затруднил получение и анализ гомозигот по встройке конструкции pBi-Nk.

В то же время стоит отметить, что замолкание маркерного гена не отражает неэффективной работы генетической конструкции, несущей супрессор. Наоборот, по-видимому, существует положительная корреляция между замолканием маркерного гена nptII и эффективностью инактивации гена-мишени Nk1.
Морфология и вирусоустойчивость трансгенных растений. Для сравнительного анализа всхожести и скорости прорастания семян растений, экспрессирующих РНКазу ZRNaseII Zinnia elegans, были использованы семена (поколение Т2) линий RNS 1.5, RNS 1.6 и RNS 5.4, гомозиготных по инсерции конструкции pBi-RNS, и семена исходных нетрансгенных растений линии SR1. Обнаружено, что при проращивании в стерильных условиях на среде MS при t = 220С семена трансгенных и контрольных линий не отличаются друг от друга по энергии прорастания (рис. 7А).

Проростки поколения Т2 линий RNS 1.5, RNS 1.6 и RNS 5.4 и проростки линии SR1, использованные при сравнительном анализе всхожести и скорости прорастания семян, были пересажены в горшки и выращивались при t = 220С до наступления стадии цветения. У растений была измерена длина стебля и был произведен подсчет числа листьев (рис. 8). Полученные результаты показывают, что по морфологическим параметрам трансгенные растения табака, экспрессирующие РНКазу ZRNase II Z. elegans, не проявляют видимых отличий от контрольных растений табака. Кроме того, трансгенные растения, экспрессирующие РНКазу ZRNase II, не отличаются от контрольных растений по срокам цветения.

Сравнительный анализ всхожести и скорости прорастания семян растений, несущих супрессор рибонуклеазы Nk1 Nicotiana tabacum, проводили на семенах поколения Т1, полученных при самоопылении первичных трансформантов. В этом случае должно наблюдаться расщепление (в зависимости от копийности Т-ДНК инсерции). И если супрессия гена Nk1 приводит к морфофизиологическим отличиям, проростки на чашке должны были бы быть неодинаковы. Однако при проращивании в стерильных условиях на среде MS при t = 220С проростки поколения Т1 не отличаются от контрольных по всхожести и скорости прорастания (рис. 7Б). Кроме того, при работе с первичными трансформантами табака, несущими генетическую конструкцию pBi-Nk, не было обнаружено существенных морфологических отличий от нетрансгенных растений табака.


А



Б




Рисунок 7. Сравнительный анализ всхожести и скорости прорастания растений, несущих конструкции pBi-RNS и pBi-Nk:

А. RNS 1.5 – потомки трансформанта №1 (поколение Т2), гомозиготные по инсерции Т-ДНК pBi-RNS;

Б. Nk 8 – потомки трансформанта №8, несущего конструкцию pBi-Nk (поколение Т1), полученные самоопылением.

В качестве контроля использовались нетрансгенные семена табака линии SR1.



А

Б




Рисунок 8. Сравнительный морфометрический анализ контрольных (линия SR1 табака) и трансгенных растений поколения Т2, несущих РНКазу ZRNaseII Zinnia elegans: А. Длина стебля; Б. Число листьев.
Эти результаты указывают на то, что в нормальных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не оказывает заметного влияния на процессы роста и развития. Однако остается открытым вопрос о влиянии уровня РНКазной активности в апопласте на развитие растений в условиях, отличающихся от тепличных или in vitro.

Этот результат находится в согласии с данными, полученными при анализе трансгенных растений Lycopersicon esculentum, несущих антисмысловой супрессор внутриклеточной S-подобной РНКазы LX (Lers et al., 2006). Растения, характеризовавшиеся пониженной экспрессией РНКазы LX, не проявляли существенных фенотипических отличий от нетрансгенных растений при выращивании на стандартной среде в условиях in vitro.

Нами также была протестирована вирусоустойчивость микроклонированных первичных трансформантов, экспрессирующих РНКазу ZRNaseII Zinnia elegans. Из проанализированных четырех независимых трансформантов три (№1, №5 и №10) продемонстрировали значительную задержку в развитии симптомов болезни в зависимости от концентрации вируса табачной мозаики (ВТМ) в инокулюме и при этом характеризовались пониженным накоплением вирусного белка (табл. 1). Тот факт, что трансформант №2 не отличался от контрольных растений по вирусоустойчивости, по-видимому, объясняется Т-инсерционным мутагенезом – вероятно, встройка Т-ДНК привела к мутации, ослабившей устойчивость этого трансформанта к ВТМ.

Полученные результаты показывают, что высокий уровень активности РНКазы ZRNaseII Zinnia elegans повышает устойчивость трансгенных растений табака к ВТМ, и подтверждают гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в механизмах защиты от патогенов. Эти результаты согласуются с данными, полученными при анализе вирусоустойчивости растений табака, экспрессирующих панкреатическую РНКазу быка (Trifonova et al., 2007).

В настоящее время механизмы противовирусного действия экстраклеточных РНКаз остаются неясными. Вероятно, экстраклеточные РНКазы могут повреждать геномную РНК вирусов на тех стадиях инфекционного процесса, когда она открыта для внешнего воздействия. Также можно предположить, что во время инокуляции при поранении тканей РНКазы из апопласта могут проникать в поврежденные клетки и убивать их (разрушая пул клеточных мРНК), что не дает вирусу возможности размножиться (Trifonova et al., 2007). Последний механизм может действовать и в естественных условиях: проникновение вирусов в растение, как правило, связано с механическим повреждением тканей растения, что, в свою очередь, позволяет экстраклеточным РНКазам проникать в клетки и должно вызывать гибель поврежденных клеток вследствие цитотоксического действия этих белков.

Таблица 1. Проявление симптомов болезни* и содержание вирусного антигена в листьях контрольных и трансгенных растений табака (T0) (мкг/см2 поверхности листа)

*Наличие фенотипических симптомов болезни определялось на 7, 14 и 21 день после инокуляции (ДПИ): «−» - симптомы отсутствовали; «+» - симптомы присутствовали.



Трансгенные растения как модель для изучения функций S-подобных РНКаз. Насколько нам известно из литературных данных, число работ, посвященных изучению функциональной роли S-подобных рибонуклеаз и связанных с созданием трансгенных растений, невелико. При этом большинство из них включает в себя анализ активности промоторов исследуемых генов с помощью генов-репортеров (Gross et al., 2004; Kock et al., 2004; Kock et al., 2006; Hillwig et al., 2008). Получение трансгенных растений с измененной активностью S-подобных РНКаз – один из перспективных подходов для изучения их функций на белковом уровне. Из литературы нам известны две работы, связанные с получением и анализом растений со сниженной активностью изучаемой РНКазы. В работе Bariola et al. (1999) были получены растения арабидопсиса с пониженной экспрессией экстраклеточной РНКазы RNS1 и внутриклеточной RNS2. Работа Lers et al. (2006) была посвящена анализу трансгенных растений Lycopersicon esculentum с пониженной экспрессией гена внутриклеточной РНКазы LX.

Таким образом, до настоящего времени растения арабидопсиса с пониженной экспрессией экстраклеточной РНКазы RNS1 были единственной генетической моделью с пониженной активностью экстраклеточной S-подобной РНКазы. Следовательно, полученные в данной работе трансгенные растения табака с пониженной активностью РНКазы Nk1 – еще одна модель такого рода, пригодная для изучения функций экстраклеточных РНКаз растений. Стоит отметить, что трансгенные растения, полученные в рамках данной работы, характеризуются более эффективным снижением активности экстраклеточной РНКазы по сравнению с растениями арабидопсиса, что, по-видимому, связано с использованием двуцепочечного супрессора.

Что касается трансгенных растений с повышенной активностью растительных секреторных РНКаз, то в литературе мы не нашли упоминания о таких моделях, и полученные нами растения представляют собой единственный пример такого рода.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В рамках диссертационной работы было проведено исследование влияния повышенного и пониженного уровня активности экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз на процессы роста и развития растений, а также на их вирусоустойчивость. С этой целью были созданы 2 генетические конструкции для трансформации растений (pBi-RNS и pBi-Nk), получены трансгенные растения табака и проведен анализ их морфологических, биохимических и физиологических характеристик.

В ходе анализа трансгенных растений были получены следующие результаты. В трансформантах табака, несущих конструкцию pBi-RNS, РНКаза ZRNaseII Zinnia elegans эффективно экспрессируется и локализована в апопласте. В трансформантах табака, несущих конструкцию pBi-Nk, происходит существенное снижение активности экстраклеточной РНКазы Nk1. Семена трансгенных растений не отличаются от контрольных по всхожести и скорости прорастания при проращивании в стерильных условиях на стандартной среде MS, а взрослые трансгенные растения не проявляют видимых отличий от нетрансгенных растений по морфологии и срокам цветения. При этом высокий уровень активности РНКазы ZRNaseII Z. elegans повышает устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.

Полученные результаты подтверждают гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к вирусам. Также они позволяют предположить, что в использованных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не влияет на процессы роста и развития. Кроме того, результаты, полученные в данной работе, показывают, что экстраклеточные рибонуклеазы растений могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной вирусоустойчивостью.

Полученная модель может быть в дальнейшем использована для изучения роли S-подобных рибонуклеаз.




ВЫВОДЫ


  1. Разработаны и созданы две генетические конструкции, обеспечивающие в растениях табака а) сверхэкспрессию экстраклеточной РНКазы ZRNaseII Zinnia elegans; б) эффективную инактивацию гена собственной экстраклеточной РНКазы Nk1 Nicotiana tabacum;

  2. Получена новая генетическая модель - линии трансгенных растений табака Nicotiana tabacum SR1, характеризующихся модифицированным уровнем активности экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз: а) увеличенным по сравнению с контрольными растениями; б) сниженным по сравнению с контрольными растениями.

  3. Показано, что растения табака с повышенной активностью экстраклеточной рибонуклеазы характеризуются увеличенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики. Это подтверждает гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к вирусам.

  4. Установлено, что трансгенные растения табака не проявляют отличий от контрольных нетрансгенных растений по морфологии и параметрам развития. Это указывает на то, что в нормальных условиях экстраклеточные рибонуклеазы растений не играют существенной роли в контроле процессов роста и развития.

ПУБЛИКАЦИИ


  1. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С.Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В., Шумный В.К. Эффективная экспрессия гена экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans в растениях табака Nicotiana tabacum SR1 // Генетика. 2007. Т. 43. № 2. С. 1002-1005.

  2. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С. Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В. Инактивация гена Nk1 в растениях табака Nicotiana tabacum SR1 за счет РНК-интерференции // Генетика. 2010. Т. 46. № 1. С. 131-134.

  3. Сангаев С.С., Кочетов А.В., Ибрагимова С.С., Левенко Б.А., Шумный В.К. Роль экстраклеточных рибонуклеаз в физиологических процессах высших растений // Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 2. С. 232-242.

  4. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С.Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Кочетов А.В., Шумный В.К. Супрессия гена экстраклеточной рибонуклеазы Nk1 в растениях табака Nicotiana tabacum SR1 // Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 16-19 сентября 2007. С. 240-242.

  5. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С.Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В., Шумный В.К. Изучение роли экстраклеточных рибонуклеаз, индуцируемых поранением, на модели трансгенных растений // Материалы Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 18-24 июня 2007. Часть 3. С. 266-267.

  6. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Романова А.В., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В. Трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз как модель для изучения молекулярных механизмов защиты от вирусов // Тезисы Международной научной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Москва, 8-12 декабря 2008. С. 63.

  7. S.S. Sangaev, A.V. Romanova, E.A. Trifonova, M.V. Sapotsky, V.I. Malinovsky and A.V. Kochetov. Transgenic plants with a modified level of extracellular ribonuclease activity as a new genetic model // Russian-French Conference “Problems and Prospects in Plant Biotechnology”, Novosibirsk, October 21-24, 2008. http://www.bionet.nsc.ru/meeting/rus_france2008/Theses/

  8. S.S. Sangaev, A.V. Romanova, E.A. Trifonova, M.V. Sapotsky, V.I. Malinovsky and A.V. Kochetov. Transgenic plants with a modified level of extracellular ribonuclease activity as a new genetic model // Abstracts of the German-Russian Forum Biotechnology GRFB’09, Novosibirsk, June 15-19, 2009. P. 44.



База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка