Научно-издательский центр «Открытие» otkritieinfo ru Современная биология: вопросы и ответы




старонка7/11
Дата канвертавання24.04.2016
Памер1.98 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

А. Н. Харламова, О. В. Петракова И. Е. Гурманчук


Белорусский государственный медицинский университет,

г. Минск, РБ, www.nastya.kharlamova@ki.se
Термическая травма занимает ведущее место по летальности среди других видов травм. С учетом того, что состояние раны во многом определяется уровнем активности иммунной системы, нами была выдвинута гипотеза о том, что в процессе заживления немаловажное значение имеет оценка состояния раневой поверхности ожоговой раны, а также определение критических факторов сопряженных с эффективной и качественной репарацией.

Материалы и методы исследований. Для выделения лимфоцитов из интактных участков кожи, участков грануляции и гипергрануляции применяли классический способ, который подразумевает использование ферментов, а именно колагеназы, гиалуронидазы и ДНКазы. Материал (фрагмент кожи весом 0,5 грамм) погружали на 2 часа в раствор Хенкса, содержащий 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Затем разрезали на мелкие фрагменты и помещали в раствор комплекса ферментов (коллагеназы, гиалуронидазы, ДНКазы I) в RPMI-1640 c 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина. После 18 часовой (10 часовой, в случае выделения клеток из участков грануляции/гипергрануляуии) инкубации, суспензию клеток отбирали и отмывали дважды в растворе Хенкса, содержащем 2% эмбриональной телячьей сыворотки. На заключительном этапе полученную суспензию клеток центрифугировали на градиенте Ficoll-Paque, полученные клетки отмывали, оценивали их количество, состав и жизнеспособность (с помощью 0,2% трипанового синего).

Исследование экспрессии поверхностных маркеров на выделенных клетках проводили на проточном цитометре Becton Dickinson FACSCalibur с использованием моноклональных антител меченых флюорохромом. Определяли следующие субпопуляции клеток: CD3αβ, CD3δ, CD4, CD8, HLA-DR, CD14, CD45.



Результаты исследований. Возможно как минимум три исхода заживления раны: нормальное, вялотекущее и с образованием гипертрофических рубцов. Участие иммунных факторов сопровождает все варианты заживления. При сбалансированном соотношении регенерации и воспаления происходит оптимальное заживление раны и образование грануляционной ткани. Исследование фенотипических характеристик полученных клеток показало (табл.1), что из участков грануляции на долю лейкоцитов (CD45) приходится около 83% от всех выделяемых клеток. Что касается субпопуляций Т-лимфоцитов, то на долю CD3αβ приходится 36%, а на долю CD3δ - 6%, цитотоксические лимфоциты составляют 3% от общей популяции лейкоцитов. При этом на долю CD14 приходится около 10%, а на клетки, экспрессирующие на своей поверхности HLA-DR лишь 2% от общей популяции лейкоцитов.

Таблица1. Популяционный состав клеток

раневой поверхности и интактной кожи человека


Популяци-онный

состав клеток, %



Материал

Интакт-ная кожа

Участки грануляция

Участки гипергрануля-ции

CD45

14,0±0,08

*


82,5±0,6

**


74,8±1,67

***


CD3αβ

12,3±0,99

*


35,3±2,06

40,0±2,04

***


CD3δ

10,1±0,78

*


7,3±0,75

**


2,6±0,22

***


CD8

12,1±0,86

*


2,9±0,5

**


20,0±0,41

***


CD14

8,5±3,28

11±1,68

8,5±3,23

HLA-DR

2,2±0,27

1,5±0,46

**


20,4±0,14

***


CD4

0,0±0,03

0,2±0,1

0,0±0,02

* – отличия достоверны между интактной кожей и грануляцией, р<0,05

** – отличия достоверны между грануляцией и гипергрануляцией, р<0,05

*** – отличия достоверны между интактной кожей и гипергрануляцией, р<0,05


Одним из вариантов патологического течения репаративного процесса является разрастание соединительной ткани и образование т.н. участков гипергрануляции, которая выдавливается на уровне окружающей кожи и фактически блокирует реэпителизацию. Гипергрануляция характеризуется высокой степенью содержания клеточных элементов и нарушением механизма апоптоза клеток. В ходе работы из участков с гипергрануляцией удалось обнаружить около 75,5% лейкоцитов (CD45) от общего количества всех выделенных клеток, из которых CD3αβ составляли 40%, CD3δ - 2,6%, на долю CD8 лимфоцитов приходится 20%, а на клетки, несущие на своей поверхности HLA-DR – 20,7%. Популяций лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD4 молекулу не в участках грануляций не в участках гипергрануляций найдено не было (табл.1).

Что касается участков интактной кожи, то при фенотипировании клеток, показано, что на долю лейкоцитов (CD45) приходится около 14% от всех выделенных из биопатата кожи клеток. При этом около 12% составляют лимфоциты, несущие CD3αβ. На долю же γδ+ Т-лимфоцитов приходится около 10%, а на долю CD8 лимфоцитов приходится 12% от популяции лейкоцитов (табл.1).



Выводы: Таким образом, при «нормальном» процессе репарации с образованием грануляционной ткани, раневой инфильтрат характеризуется достаточно большим количеством лейкоцитов по сравнению с интактным участком кожи. Гипергрануляции характеризуются значительным увеличением количества клеток, экспрессирующих HLA-DR. В целом в составе инфильтратов участков гипергрануляций регистрировалось также большее количество цитотоксических лимфоцитов по сравнению с участками грануляционной ткани. А количество Т-лимфоцитов, имеющих TCR γδ было значительно меньше чем в инфильтратах с грануляциями.

Дальнейшее изучение фенотипических и других параметров лейкоцитов, а также их соотношений в инфильтратах раны позволит прогнозировать течение репаративного процесса.




Секция 10. Биологические аспекты сельского хозяйства


1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка