Farmacognozie şi botanică farmaceutică contribuţii la standardizarea frunzelor cu flori de crataegus monogyna jacq. ŞI crataegus curvisepala lindm. ŞI a produselor extractive ana Casian1, Igor Casian1, Ion Ungureanu2




Дата канвертавання18.04.2016
Памер45.05 Kb.
FARMACOGNOZIE ŞI BOTANICĂ FARMACEUTICĂ



CONTRIBUŢII LA STANDARDIZAREA FRUNZELOR CU FLORI DE CRATAEGUS MONOGYNA JACQ. ŞI CRATAEGUS CURVISEPALA LINDM. ŞI A PRODUSELOR EXTRACTIVE

Ana Casian1, Igor Casian1, Ion Ungureanu2
Centrul Ştiinţific în domeniul Medicamentului1, Centrul de Cultivare a Plantelor Medicinale2


Summary

Contributions to standardization of the Crataegus monogyna Jacq. and Crataegus curvisepala Lindm. leaf and flowers, and extractive products

A simple and rapid HPLC-UV method has been developed to quantify pharmacologically active compounds in leaf and flowers of Hawthorn (Crataegus monogyna Jacq. and Crataegus curvisepala Lindm.) and in extractive products.

The whole standardization procedure also includes the quantification of total procyanidins by Folin-Ciocalteu method.

The proposed HPLC method allowed to simplify considerably the procedure of sample preparation.



Rezumat

S-a elaborat o metodă HPLC-UV simplă şi rapidă pentru dozarea compuşilor farmacologic activi în frunze şi flori de păducel (Crataegus monogyna Jacq. Şi Crataegus curvisepala Lindm.) şi în produsele extractive.

Procedura de standardizare în ansamblu include de asemenea dozarea procianidinelor totale prin metoda Folin-Ciocâlteu.

Metoda HPLC propusă a permis de a simplifica considerabil procedura de preparare a probelor.

Actualitatea temei

În ultimul deceniu nomenclatura fitopreparatelor a crescut considerabil, inclusiv şi a celor aplicate în terapia cardiacă.

Păducelul (genul Crataegus, familia Rosaceae) este utilizat în practica medicală în special în calitate de remediu antiaritmic, cardiotonic, antihipertensiv, sedativ ş. a. Se utilizează florile şi frunzele, recoltate în perioada butonizării şi înfloririi, totodată şi fructele la etapa maturării lor depline. Există o gamă largă de produse farmaceutice din păducel, sub formă de extract uscat şi tincturi.

Compoziţia chimică a păducelului este complexă şi include compuşi din diverse grupe, cum ar fi procianidine oligomerice, acizi oxicinamici, flavanoizi – derivaţi ai apigeninei, cvercetinei ş. a. Plantele medicinale a aceleaşi specii pot să difere după conţinutul unor compuşi activi datorită multor factori (variaţia genetică a speciei, condiţiile de creştere, timpul colectării, condiţiile de uscare şi păstrare), fapt ce modifică efectul terapeutic.

Din aceste considerente speciile C. monogyna Jacq. şi C. curvisepala Lindm., întâlnite mai des prin pădurile şi unele parcuri ale Moldovei, necesită un studiu mai profund din punct de vedere al factorilor sus nominalizaţi. Una din cerinţele contemporane către plantele medicinale este standardizarea lor după substanţele active, care trebuie să aibă o nouă strategie a studiului şi anume:



  • elaborarea şi aplicarea metodelor moderne, de înaltă performanţă pentru standardizarea fitopreparatelor înainte de a efectua studii farmacologice şi clinice sistematice;

  • estimarea efectului farmacologic al compuşilor individuali activi şi în componenţa extractelor din plante pentru a elucida mecanismul de acţiune, inclusiv şi efectele sinergice posibile dintre ei;

  • studii clinice placebo-controlate cu efectuarea paralelă sau ulterioară a investigaţiilor de farmacocinetică şi biodisponibilitate 1.



Obiectivele lucrării

Scopul prezentei lucrării constă în elaborarea unor proceduri simple şi eficace de dozarea a mai multor compuşi activi în speciile C. monogyna Jacq. şi C. curvisepala Lindm., care pot fi utilizate pentru standardizarea materiei prime şi a produselor extractive.

Materiale şi metode

În lucru s-a utilizat cromatograful de lichide din seria Jasco LC-2000, dotat cu două pompe, amestecător dinamic sau static (opţional) de presiune înaltă, injector manual, termostat de coloane şi detector UV-VIS cu şir de diode (DAD). Componenţii soluţiei tampon au fost cu grad de puritate “chimic pur”, iar acetonitrilul – “pentru HPLC”. Substanţele de referinţă au fost procurate de la “Fluka” şi “Sigma-Aldrich”.

Rezultate şi discuţii

Metodele de dozare a compuşilor activi în frunzele cu flori de păducel, incluse în USP-29 [2], presupun hidroliza diferitor glicozide flavonice şi flavonolice până la vitexin şi quercetină corespunzător înaintea separării lor cromatografice. Această abordare permite analiza diferitor specii din genul Crataegus prin metode unificate, iar prepararea probelor pentru cele două grupe de flavonoizi este îndelungată şi separată. De pe altă parte, prepararea probelor cu mai multe etape, inclusiv transformarea chimică, poate deveni o sursă de majorare a erorii la analiza cantitativă. Luând in consideraţie faptul că în Republica Moldova sunt două specii mai răspândite (C. monogyna Jacq. şi C. curvisepala Lindm.), care prezintă interes pentru industria farmaceutică, am avut ca obiectiv studiul lor, realizarea căruia necesită elaborarea unei metode simple pentru analiza speciilor sus numite, care va permite dozarea diferitor grupe de flavonoizi într-o singură probă fără hidroliza lor preliminară.

Separarea cromatografică s-a realizat pe coloana analitică cu faza inversă (C-18) în gradient de concentraţie a acetonitrilului în tampon fosfat. În faze mobile acide flavonoizii formează picuri cromatografice cu forma mai bună, dar în cazul dat se observă interferenţă din partea unor acizi fenolcarbonici, înlăturarea căreia s-a realizat utilizând tamponul cu pH-ul circa 6,2. În calitatea de lungime de undă analitică s-a stabilit lungimea 340 nm, corespunzătoare cu maximul de absorbanţă a glicozidelor flavonice. De menţionat, că şi alte grupe de compuşi fenolici posedă la aceasta lungimea de undă absorbanţa suficientă pentru analiza cantitativă.

Condiţiile cromatografice au fost optimizate pentru atingerea rezoluţiei suficiente la durata minimă a analizei, luând în consideraţie faptul că profilul gradientului real diferă de cel programat şi depinde de parametrii sistemului cromatografic, în special ai amestecătorului de solvenţi. În rezultat am obţinut două variante ale metodei, orientate la utilizarea amestecătorului dinamic Jasco MX-2080-32 (volumul camerei de amestecare 1,5 ml) şi amestecătorului static Jasco HG-980-30. Forma gradientelor reale la ieşirea din coloană a fost calculată, aplicând modelul matematic, alcătuit din camera ideală de amestecare şi camera ideală de substituire, conectate consecutiv. Valorile volumului camerei de substituire, precum şi volumul efectiv al camerei de amestecare (pentru amestecătorul static) s-au evaluat din cromatogramele ce prezintă răspunsul sistemului la schimbarea prin salt a concentraţiei acetonitrilului în faza mobilă.

Varianta 1 (pentru sistem cu amestecător dinamic).

Condiţii cromatografice: Coloana Uptisphere 3 ODB cu dimensiunile interne 4.6 x 150 mm; faza A – acetonitril; faza B – tampon fosfat: 0,05 M KH2PO4 + 0,01 M K2HPO4; gradient linear de la 6% până 33% A în B timp de 15 min cu viteza volumetrică 1 ml/min; timpul înregistrării cromatogramei – 18 min; intervalul de injectare a probelor – 22 min.




Fig. 1. Cromatogramele extractului din frunze cu flori de C. monogyna Jacq. şi C. curvisepala Lindm. şi forma gradientului programat şi real (calculat) la ieşirea din coloană la utilizarea amestecătorului dinamic (a) şi static (b). Componenţii identificaţi: 1 – acizi oxicinamici; 2 – vitexin-2"-O-ramnozidă; 3 –rutozidă; 4 – hiperozidă; 5 – isocvercitrină; 6 – monoacetil-vitexin-2"-O-ramnozidă.

Cromatograma extractului din frunze şi flori de păducel, obţinută în aceste condiţii, este prezentată pe fig. 1a. Compuşii activi au fost identificaţi după corespunderea timpurilor de retenţie (pentru substanţe individuale) şi a spectrelor de absorbţie în UV-VIS (pentru grupele chimice), folosind substanţele de referinţă: acid clorogenic, rutozidă, hiperozidă şi vitexin-2"-O-ramnozidă.



Varianta 2 (pentru sistem cu amestecător static).

La utilizarea sistemului cu amestecător static, care a demonstrat un volum efectiv mult mai mic al camerei de amestecare (circa 0,5 ml), se observă, de asemenea, şi reducerea timpului de restabilire a condiţiilor iniţiale în sistemul cromatografic după finisarea programului de gradient (cum se vede pe fig. 1b). Acest fapt a permis diminuarea intervalului de injectare a probelor. Reducerea ulterioară a timpului de analiză s-a dovedit a fi posibilă prin aplicarea gradientului cu mai multe segmente: 9% A în B / 0-1 min; 9-15% A în B / 1-1,1 min; 15-28% A în B / 1,1-9 min; timpul înregistrării cromatogramei – 12,6 min; intervalul de injectare a probelor – 14 min. Restul condiţiilor cromatografice sunt aceleaşi ca şi în varianta 1.

Pentru analiza cantitativă în ambele variante s-a aplicat metoda standardului extern, utilizând soluţia de calibrare cu conţinut de acid clorogenic, hiperozidă şi vitexin-2"-O-ramnozidă, a câte 40 mg/l fiecare. Glicozidele flavonice – grupul principal al substanţelor active – se determină după suma ariilor picurilor de vitexin-2"-O-ramnozidă şi monoacetil-vitexin-2"-O-ramnozidă în recalculare la vitexin-2"-O-ramnozidă; glicozidele flavonolice – după suma picurilor de hiperozidă, isocvercitrină şi rutozidă (dacă se depistează pe cromatogramă) în recalculare la hiperozidă. Metoda permite de asemenea dozarea sumei acizilor oxicinamici (recalculate la acid clorogenic), rolul cărora în acţiunea farmacologică până în prezent nu este stabilit definitiv.

Pentru analiza produsului vegetal s-a utilizat o simplă tehnica de preparare a probelor: Circa 0,5 g (masa exactă) materie primă fragmentată, care trece prin sita cu diametru orificiilor 1 mm, se introduce în balon cu capacitatea 100 ml, se adaugă 50 ml alcool etilic 40%, se încălzeşte pe baia de apă la temperatura 60  2°C timp de 30 min, amestecând periodic. Apoi conţinutul balonului se filtrează prin tampon de vată într-un balon cotat cu capacitatea 100 ml. Tamponul cu materia primă se reîntorc în primul balon şi extracţia se repetă încă o dată în aceleaşi condiţii. Extractul sumar se răceşte până la temperatura 20°C şi se completează până la volumul de 100 ml cu extragent pur. Alicota se centrifughează 5 min la 3000-4000 g. Câte 10 l probă obţinută şi a soluţiei standard se injectează consecutiv în sistemul cromatografic. Regăsirea analiţilor la aplicarea acestei tehnicii de extracţie constituie circa 99% pentru glicozide flavonice şi flavonolice şi circa 96% pentru acizi oxicinamici.

La analiza produselor extractive din frunze cu flori de păducel se aplică diluarea de 20-100 ori (pentru tincturi şi extracte lichide) sau dizolvarea în alcool etilic 20-40% (pentru extractele uscate şi formele farmaceutice solide), urmată de centrifugare sau filtrarea prin membrană.

Dozarea prin metoda HPLC a procianidinelor – uneia din grupele de substanţe active – este problematică, deoarece pe cromatograme se depistează doar catehina, epicatehina şi unii oligomeri inferiori (detectaţi la 280 nm), care prezintă doar o parte minoră din conţinutul total al procianidinelor. Soluţionarea acestei probleme este posibilă prin dozarea procianidinelor, exprimate ca suma compuşilor fenolici, aplicând metoda Folin-Ciocâlteu [3], având în vedere faptul, că procianidinele constituie o parte majoră din cantitatea totală a componenţilor fenolici în această plantă. Noi am folosit metoda modificată în varianta semi-micro. Esenţa modificării constă în majorarea valorii pH-ului amestecului reactant prin înlocuirea soluţiei carbonat de sodiu concentrat cu tampon carbonat-hidroxid. Ca rezultat timpul optim al reacţiei s-a micşorat până la 10-15 min.



Tehnica de lucru pentru dozarea sumei compuşilor fenolici: 20 l probă, preparată pentru analiza HPLC, se diluează cu 2 ml apă, se adaugă 30 l reactiv Folin-Ciocâlteu (descris în Farmacopeea Europeană sub denumirea de reactiv fosfomolibdenowolframic [4, 5]), apoi se adaugă 400 l soluţie tampon cu conţinut de 0,4 Mol/l Na2CO3 şi 0,3 Mol/l NaOH. În intervalul 10-15 min după adăugarea ultimului reactiv se citeşte absorbanţa la lungimea de undă 740 nm, folosind în calitate de soluţie de compensare amestecul de reactivi. Paralel se citeşte absorbanţa probei de etalonare, preparate din 20 l soluţie alcoolică de (-) epicatehină 0,5 mg/ml. Circa 75% din valoarea găsită aparţine sumei procianidinelor. Alte substanţe fenolice de asemenea reacţionează cu reactivul Folin-Ciocâlteu, dar cu sensibilitatea redusă. Răspunsul relativ faţa de (-) epicatehină a constat 0.89 pentru acidul clorogenic, 0.64 pentru hiperozidă şi 0.41 pentru vitexin-2"-O-ramnozidă.

Recomandăm de-a include acest test în documentaţia analitică de normare a calităţii atât a materiei prime cât şi produselor farmaceutice din păducel, fiind că procianidinele sunt substanţe uşor oxidabile şi cantitatea lor se poate micşora esenţial în condiţii nefavorabile de uscare şi păstrare a materiei prime, precum şi în decursul unor procese tehnologice de fabricare a produselor extractive.

Analiza eşantioanelor de frunze cu flori de păducel, colectate în ultimii 3 ani din diferite localităţi în centrul republicii, a demonstrat că componenţa chimică (după grupe) a speciilor este destul de reproductibilă şi se exprimă prin următoarele valori generalizate: Glicozide flavonice (recalculate la vitexin-2"-O-ramnozidă) – 8-10 mg/g; glicozide flavonolice (recalculate la hiperozidă) – 5-7 mg/g; acizi oxicinamici (recalculate la acid clorogenic) – 13-20 mg/g; suma substanţelor fenolice (recalculate la (-) epicatehină) – 80-100 mg/g. Componenţa chimica a celor două specii studiate este asemănătoare, cu excepţia faptului că C. monogyna nu conţine compusul monoacetil-vitexin-2"-O-ramnozidă, în timp ce suma glicozidelor flavonice in ambele specii este foarte apropiată.
Concluzii

S-a elaborat metoda HPLC-UV rapidă şi eficientă pentru dozarea glicozidelor flavonice şi flavonolice, precum şi a acizilor oxicinamici în speciile Crataegus monogyna Jacq. şi Crataegus curvisepala Lindm., care poate fi aplicată la standardizarea materiei prime şi produselor extractive.

Se recomandă includerea în procedura de standardizare şi dozare a sumei procianidinelor prin metoda Folin-Ciocâlteu, fiind substanţele cele mai labile în condiţii nefavorabile de păstrare şi prelucrare a materiei prime.
Bibliografie


  1. Wagner H. Natural products chemistry and phytomedicine research in the new millennium: new developments and challenges. ARKIVOC 2004 (vii) p. 277-284.

  2. Hawthorn leaf with flower. USP 29–NF 24, p. 2348.

  3. European Pharmacopoeia, 6th edition, 2009 (6.5), art. 2.8.14. Determination of tannins in herbal drugs.

  4. European Pharmacopoeia, 6th edition, 2009 (6.5), art. 4.01.01. Reagents.

  5. Farmacopeea Română, ediţia X, p. 1218.



CENTAUREA CYANUS L. – SURSĂ DE POLIZAHARIDE

Tatiana Chiru, Anatolie Nistreanu, Rodica Gaiduc

Catedra Farmacognozie şi Botanică farmaceutică USMF „Nicolae Testemiţanu”


Summary

Centaurea cyanus L. – source of polysaccharides

Nowadays the interest in polysaccharides, particularly of vegetable nature, as substances with low toxicity, is growing. Natural products with polysaccharides have pectoris, antiulcer, immunostimulating, antimicrobial, anti-inflammatory, laxative, diaphoretic properties. Therefore, the study of medicinal plants containing polysaccharides is actual today and will be useful for the future elaboration of new pharmaceutical drugs.



Rezumat

În prezent interesul faţă de polizaharide, în special celor vegetale, ca substanţe cu toxicitate redusă, se află în continuă creştere. Produsele naturale cu conţinut de polizaharide posedă proprietăţi pectorale, antiulceroase, imunostimulatoare, antimicrobiene, antiinflamatoare, laxative, diaforetice, demulcente, energizante etc. De aceea, studiul plantelor medicinale cu conţinut de polizaharide este actual şi prezintă interes pentru elaborarea în viitor a unor noi forme farmaceutice.


Actualitatea temei

După gradul de complexitate polizaharidele pot să fie omogene (amidon, celuloză, inulină) sau neomogene (pectine, gume, mucilagii). În prezent interesul faţă de acestea a crescut considerabil. Dacă în trecut ele se utilizau ca substanţe auxiliare în tehnologia medicamentelor, ultimii ani tot mai frecvent servesc ca principii biologic active [3].

De mult timp se cunosc efectele emoliente şi purgative ale polizaharidelor (seminţele de in, dovleac); expectorante şi antiinflamatoare (rădăcini de nalbă mare, frunze de pătlagină, podbal) [1,2,3,4].

Pe scară largă se utilizează pectinele în terapie în calitate de preparate hemostatice, sorbenţi, contribuind la eliminarea din organism a metalelor grele (Pb, Co, Cu), reduc toxicitatea salicilaţilor, posedă activitate antiulceroasă şi uşor laxativă. Graţie acestor proprietăţi, produsele cu conţinut de pectine (fructe de măr, citruşi, sfeclă) sunt recomandate populaţiei din zonele radioactiv poluate. Substanţele pectice posedă activitate antiinflamatoare şi hipotensivă. Recomandabilă este combinaţia pectină şi inulină, care pe larg se utilizează în diabet zaharat (tuberculi de topinambur) [4].

În ultimul timp tot mai multă atenţie se acordă acţiunii imunostimulatoare (alginat de Na, translam), antitumorală (Solidago sp., Rumex acetosella L., Trifolium pratense L., Arctium lappa L.), hepatoprotectoare (Verbascum sp., Plantago major L., Cucurbita pepo L.) a polizaharidelor [1,4].

Albăstriţa (Centaurea cyanus L.) fam. Asteraceae – plantă anuală, utilizată în medicină ca diuretic, coleretic, antidiareic. În Franţa, Marea Britanie, Germania este indicată în inflamaţii minore oculare, efectul antiinflamator fiind datorat polizaharidelor [5].


Obiectivele lucrării

  • Studiul pieţii farmaceutice a Republicii Moldova, cu scopul de a determina cota parte de fitopreparate autohtone şi de import cu conţinut de polizaharide ca principii active de bază;

  • Determinarea totalului polizaharidelor în părţi aeriene şi inflorescenţe ale speciei C. cyanus L.


Materiale şi metode

Materialul vegetal a fost reprezentat de inflorescenţe albastre şi părţi aeriene de C. cyanus L. recoltate în vara a. 2009.

Analiza cantitativă a polizaharidelor s-a efectuat prin metoda spectrofotometrică [6]: 2,0 g (masa exactă) de produs vegetal pulverizat se trec în balon conic de 100 ml, la care se adaugă 60 ml apă distilată. Conţinutul se încălzeşte pe baia de apă timp de 1 oră. După răcire extractul se filtrează într-un vas cotat de 200 ml. Extragerea se repetă în aceleaşi condiţii, după care se adaugă la filtrat apă distilată până la cotă (soluţia A). 2 ml soluţie A se trec în eprubeta de la centrifugă, se adaugă 4 ml alcool etilic 95%, se amestecă şi se încălzeşte pe baia de apă 10 min. După răcire conţinutul eprubetei se centrigughează 10 min cu viteza de rotaţie 3000 rot/min. Lichidul decantat se elimină, iar precipitatul se suspendează cu 5 ml etanol 95% şi repetat se centrifughează în aceleaşi condiţii. Lichidul decantat se înlătură, iar precipitatul se usucă cu aer cald până la înlăturarea urmelor de etanol. La precipitat se adaugă 4 ml reactiv, se încălzeşte pe baia de apă 10 min. După răcire conţinutul eprubetei se trece în vas cotat de 25 ml. Se adaugă alcool etilic de 95% până la cotă (soluţia B). Absorbanţa soluţiei B se determină spectrofotometric la lungimea de undă de 424 nm. În calitate de soluţie de referinţă se foloseşte 4 ml de reactiv, menţinut în aceleaşi condiţii ca proba de analizat.

Conţinutul de polizaharide (X, %) recalculat la acidul galacturonic se determină după formula:



,

unde D – absorbanţa soluţiei de analizat; kV – coeficientul diluării (2500); 0,91 – coeficientul de hidroliză; E – coeficientul de recalcul la GalUA(214); mmasa produsului vegetal, g; W – pierderea în masă la uscare,%.

Reactivul a fost preparat în felul următor: 100 mg antronă (МРТУ 6-09-1214-64), preventiv recristalizată din benzen, s-a trecut într-un balon cotat de 200 ml şi s-a adus până la cotă cu acid sulfuric concentrat.
Rezultate şi discuţii

Totalul polizaharidelor în inflorescenţe şi părţi aeriene de albăstriţă constituie 3,3% şi 4,02% corespunzător.

Pe piaţa farmaceutică a Republicii Moldova preparatele medicamentoase cu conţinut de polizaharide, ca principii biologic active, au în formula sa următoarele plante: nalbă mare, in de cultură, varză de mare, pătlagină îngustă, pătlagină mare, ochiul lupului, tei pucios, podbal. Din totalul produselor medicamentoase înregistrate în Republica Moldova cu polizaharide ca principii de bază, 27% revine speciilor, 12% - produselor vegetale, 60% - fitopreparatelor (fig.1). Din ele 88% sunt importate din Ucraina, Rusia, România, Germania, India, Cehia, Belorusia, Slovacia, Franţa şi numai 22% provin din ţară [2]. De aici rezultă interesul faţă de studiul florei Moldovei cu conţinut de polizaharide.

Fig. 1. Analiza produselor medicamentoase cu conţinut de polizaharide

pe piaţa farmaceutică a R. Moldova
Concluzii

S-a determinat spectrofotometric totalul polizaharidelor în inflorescenţe (3,3%) şi părţi aeriene (4,02%) de albăstriţă.

Analiza datelor din literatură şi rezultatele proprii denotă faptul că plantele medicinale din flora Moldovei cu conţinut de polizaharide necesită o studiere mai aprofundată.
Bibliografie


  1. Chiang L.C., Ng L.T. Immunomodulatory Activities of Flavonoids, Monoterpenoids, Triterpenoids, Irdoid Glycosides and Phenolic Compounds of Plantago Species. Planta medica. 2003. Vol. 69, p. 600-604.

  2. Matcovschi C., Procopişin V. Ghid farmacoterapeutic. 2004. 1248 p.

  3. Oniga I., Hanganu D. Analiza produselor naturale medicinale. Cluj-Napoca, 2004, p. 29.

  4. Криштанова Н.А., Сафонова М.Ю. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств. Вестник ВГУ. 2005. №1, С. 212-221.

  5. Муравьёва Д.А., Чушенко В.Н., Бубенчикова В.Н. Полисахариды цветков Василька синего. Фармация, М., 1987. № 2. С. 29-32.

  6. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Разработка технологии получения экстракта подорожника большого сухого. Химия растительного сырья. 2006. №1, С. 49-54.


.




База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка