Regeneración vía embriogénesis somática de una variedad colombiana élite de Theobroma cacao L. Regeneration through somatic embryogenesis of an elite colombian Theobroma cacao L. variety




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Regeneración vía embriogénesis somática de una variedad colombiana élite de Theobroma cacao L.
Regeneration through somatic embryogenesis of an elite colombian Theobroma cacao L. variety
Aura Inés Urrea Trujillo1, Lucía Atehortúa Garcés2, Adriana María Gallego Rúa3.

  1. Ph. D. en ciencias, Docente Instituto de Biología, Universidad de Antioquia (Medellín), Colombia. aurrea@matematicas.udea.edu.co

  2. Ph. D. en ciencias, Docente Instituto de Biología, Universidad de Antioquia (Medellín), Colombia. latehor@gmail.com

  3. Cand. Msc. en Biología, Investigadora grupo de Biotecnología, Universidad de Antioquia (Medellín), Colombia. adriana.gallego.02@gmail.com

Resumen
El objetivo de esta investigación fue evaluar dos protocolos de propagación vía embriogénesis somática a partir de explantes florales en dos clones élite BIOB e ICS95 de Theobroma cacao L. Se obtuvo un 50 y 32% de callo embriogénico en ICS95 y BIOB respectivamente con el protocolo de Fontanel et al. (2002), modificado después de un periodo de cultivo de tres meses. Los embriones pasaron por fases que se correspondieron con medios de cultivo diferenciales: Inducción, Formación, Maduración y Mantenimiento. Para la embriogénesis somática secundaria se obtuvo un 23% de embriones a partir de embriones somáticos primarios en un medio, conteniendo 1mg/L de 2,4,5 T (2,4,5 Triclorofenoxiacético). Se logró, además, desarrollar enraizamiento adventicio aplicando pulsos de IBA (Ácido Indol Butírico) a 0.5mg/L y 0.5g/L durante un minuto. Las plantas enraizadas se llevaron a una mezcla de tierra: arena (1:1) para su adaptación ex vitro, obteniéndose un 66% de plantas aclimatadas. Los estudios histológicos mostraron diferentes características típicas del desarrollo embriogénico. Este es el primer reporte en el que se logra de manera exitosa la conversión hasta plántula (68%) y la adaptación ex vitro de una variedad colombiana de cacao vía embriogénesis somática primaria y secundaria.
Palabras clave: Cacao, embriones somáticos, propagación in vitro, cultivo de tejidos.

Abstract
In this research we evaluate two protocols of propagation via somatic embryogenesis from floral explants using two elite clones BIOB and ICS95 of Theobroma cacao L. We obtained 50 and 32% of embryogenic callus on ICS95 and BIOB respectively with Fontanel et al., (2002) protocol modified after three months of culture. The embryos went through four phases; Induction, Formation, Maduration and Mantenimiento which corresponded each one with different media culture. For secondary somatic embryogenesis we obtained 23% of embryos from primary somatic embryos in a medium with 1mg/L of 2,4,5 T (2,4,5 Triclorofenoxiacetic). Also we obtained plants that developed new roots applying pulses with IBA (Indol Butiric Acid) 0.5mg/L and 0.5g/L for a minute. The developed plants were moved to a mix of potting soil and sand (1:1) for their ex vitro adaptation, getting 66% of acclimatized plants. The histological analysis showed the typical characteristics of the embryogenic development. This is the first report where it is achieved the successful conversion to plantlets (68%) and ex vitro adaptation of a colombian cocoa variety via primary and secondary embryogenesis.


Key words: Cacao, somatic embryos, in vitro propagation, tissue culture.
INTRODUCCIÓN
Theobroma cacao es un árbol perteneciente a la familia Malvaceae que crece en zonas tropicales húmedas y es considerado un importante cultivo a nivel mundial como materia prima para la fabricación del chocolate, el cual se produce a partir de las semillas (Despréaux, 2001). Su importancia económica es evidente en las 3.61 millones de toneladas producidas a nivel mundial. La producción para Colombia en el periodo 09/10 fue de 41 mil toneladas, lo que generó para el país un estimado de 38 mil empleos a familias campesinas de bajos recursos (FEDECACAO, 2011; ICCO, 2010).
En Colombia las variedades se obtienen básicamente por métodos tradicionales de cruces injertados entre diferentes clones, proceso que puede tomar más de 13 años para desarrollar una variedad premium. Los árboles de cacao élite presentan un alto grado de segregación cuando son multiplicados por semilla, debido a esto se han empleado diferentes sistemas de propagación clonal, tales como injertación y producción de estacas enraizadas (UNCTAD, 2008; Chávez y Mansilla, 2004). Dichos sistemas tienen un grado de efectividad variable al ser dependientes de las condiciones ambientales, de la cohesión entre la planta madre y el donador y de las enfermedades que aparecen durante el prendimiento.
Por consiguiente, se han evaluado otros métodos de propagación mediante la técnica de cultivo de tejidos. La regeneración de plantas de cacao mediante embriogénesis somática se ha establecido exitosamente a partir de explantes florales (Solano, 2008; Monsalve et al., 2005; Chanatásig, 2004), no obstante etapas como la aclimatización y evaluación en campo solo se han reportado con variedades provenientes del Oeste de la India (Maximova et al., 2008).
Inicialmente los trabajos en embriogénesis somática de cacao se enfocaron en la producción de embriones somáticos a partir de tejidos zigóticos sin lograr su desarrollo hasta planta (Janick et al., 1980). La limitación a la hora de trabajar con tejidos zigóticos es que al ser resultado de polinización cruzada, el material clonal no replica el genotipo del árbol, perdiéndose así la ganancia genética.
Posteriormente los esfuerzos se dirigieron al desarrollo de sistemas de cultivo de tejidos somáticos incluyendo hojas, con las que se presentó baja frecuencia de embriogénesis somática usando sales MS (Murashige y Skoog, 1962) y altos contenidos de auxina (Litz,

1986); con tejido nucelar se obtuvieron embriones somáticos, pero estos no maduraron (Janick, 1993; Söndahl, 1991; Esan, 1977), y utilizando explantes florales como pétalos y estaminodios se ha obtenido hasta un 90% de producción de embriones somáticos y 20% de germinación (Alemmano et al., 1997; López-Báez et al., 1993; Söndahl, 1991 y Söndahl et al. 1989). Aunque dichos sistemas fueron satisfactorios en producción de embriones somáticos, todavía eran de utilidad limitada, siendo aplicables solo a algunos genotipos y con muy bajas tasas de conversión a plántula.


Experimentos posteriores reconocieron la importancia de los reguladores de crecimiento como el Ácido Abscísico (ABA) y el Ácido Naftalenacético (ANA) en embriogénesis somática de cacao (Janick et al., 1980). Por otro lado, Guiltinan et al. (2003) desarrollaron un método eficiente de propagación usando TDZ (Thidiazuron) y las sales basales DKW (Driver y Kuniyuki, 1984), con lo que se logró establecer un protocolo para embriogénesis somática secundaria (ESS) a partir de embriones somáticos primarios, los cuales fueron convertidos a plántulas obteniéndose entre un 3.3 y 27.1% de germinación, para posteriormente establecerlas bajo condiciones de invernadero. Estos resultados constituyen una de las principales bases de la embriogénesis somática para cacao en el mundo.
Actualmente la cadena productiva colombiana de cacao enfrenta varios problemas, principalmente en el sector primario. Por un lado las condiciones ambientales fluctuantes, entre ellas los altos niveles de pluviosidad, dificultan el establecimiento de los injertos comerciales al favorecer la pudrición y, por otro, el carácter permanente de la producción del cacao que conlleva a la falta de renovación de los cultivos y el consecuente envejecimiento de los mismos (los cuales pueden alcanzar hasta 20 años), generan bajas productividades; además las plantaciones viejas se hacen susceptibles a enfermedades como la moniliasis (Moniliophthora roreri) y escoba de bruja (Moniliophthora perniciosa), las cuales causan entre el 10 y el 95% de las pérdidas del cultivo (Observatorio de Agrocadenas, 2008). Lo anterior se manifiesta a escala comercial, la cual hoy acude para la importación del grano y así responder a la demanda interna. Estas importaciones incrementan el costo del producto terminado, el cual se refleja en el precio para el consumidor (FEDECACAO 2011).
En este sentido, establecer una rápida producción masiva de clones élite que elimine la dependencia climática y el efecto de las plagas y enfermedades sería una alternativa efectiva para responder a las necesidades del mercado colombiano. De acuerdo con el estudio realizado por Solano (2008), los protocolos de propagación de cacao en general evidencian un fuerte efecto genotípico. Por tal motivo, se hace necesario establecer un protocolo de propagación para cada variedad de cacao. El objetivo de esta investigación fue evaluar protocolos de propagación clonal vía embriogénesis somática en dos variedades élite de cacao por su alta concentración de polifenoles, tamaño de grano y alta productividad.
Materiales y métodos

Material vegetal y desinfección
Botones florales de dos variedades de Theobroma cacao, BIOB (desarrollada en Colombia) e ICS95 (variedad introducida), fueron suministrados por la Compañía Nacional de Chocolates (CNCH), San Vicente de Chucurí, departamento de Santander.
Los ensayos preliminares de desinfección se basaron en el protocolo descrito por Guiltinan et al. (2003). Dado el alto porcentaje de contaminación bacteriana obtenido, se decidió evaluar diferentes antibióticos y tiempos de exposición. Los antiobiogramas permitieron determinar la estreptomicina a 250 ppm como la concentración más adecuada para el control bacteriano. El protocolo consistió en sumergir los botones florales en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 1% durante 30 minutos en constante agitación, luego se realizaron tres lavados con agua destilada estéril, se sumergieron en una solución de estreptomicina 250 ppm por 30 minutos y, finalmente, se enjuagaron de nuevo antes de la siembra.


Medios de cultivo
Se seleccionaron dos protocolos de propagación por embriogénesis somática evaluados exitosamente en otras variedades de cacao. Los protocolos fueron el desarrollado por Guiltinan et al. (2003) en Penn State University y el descrito por Fontanel et al. (2002) del Centro de Investigación de Nestlé en Tours, Francia. Las sales basales de los protocolos consistieron en DKW, MS y McCown's (Lloyd and McCown, 1981). Las fases de estos protocolos fueron: Inducción, Formación, Maduración y Mantenimiento. La denominación de los medios, de acuerdo con los autores, se presenta en la tabla 1.
Tabla 1. Descripción nominal de los medios empleados en las diferentes fases de la embriogénesis somática.




Protocolos

FASES

Guiltinan et al.

(2003)

Fontanel et al. (2002)

Inducción

PCG

INDI

Formación

SCG1, ED

INDExp

Maduración




MM6 modificado (concentración de gelificante

3.5g/L)


Mantenimiento

RD



Se utilizó también el medio de Fontanel et al. (2002) CM2 para evaluar la embriogénesis somática secundaria. Todos los medios fueron esterilizados en autoclave a 121ºC y 120 libras de presión durante 20 minutos. El manejo del material vegetal se llevó a cabo en cámara de flujo laminar horizontal.


Inducción y formación de embriones somáticos
Para la etapa de inducción se extrajeron las bases de pétalo y los estaminodios de cada botón floral y se sembraron en cajas de Petri de 60X15 mm, conteniendo 20 ml de medio de cultivo PCG o INDI. Los cultivos se mantuvieron en oscuridad por 30 días a temperatura de 25ºC + 2ºC. Se sembraron 10 explantes por caja y se establecieron 4 cajas por cada repetición. Se realizaron 3 repeticiones por tipo de explante para un total de 240 explantes.
Después de este tiempo de cultivo los explantes siguieron la secuencia de subcultivos descrita en la figura 1 (según el protocolo establecido inicialmente), hasta la formación de los embriones somáticos. Las condiciones de cultivo se mantuvieron constantes. Las variables respuesta, porcentaje de callo y porcentaje de callo embriogénico fueron registradas después de la siembra a las 4 y 8 semanas respectivamente.




Figura. 1. Secuencias de subcultivo para cada protocolo.
Maduración
Los embriones somáticos expresados en el medio INDexp del protocolo de Fontanel et al. (2002), que alcanzaron el estado cotiledonar, se aislaron y se subcultivaron en el medio de maduración MM6 del mismo protocolo. Se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 12 horas luz /12 de oscuridad, intensidad lumínica de 32mmol/m2s y temperatura de 25ºC + 2ºC. El porcentaje de plantas enraizadas, la altura (cm) y el número de hojas por planta fueron registrados 45 días después del subcultivo en MM6.
Después de 4-6 semanas, las plántulas se subcultivaron en el medio de mantenimiento del mismo protocolo. Pasados 30 días la mayoría de las plántulas se tornaron cloróticas, por lo que se reemplazó el medio de mantenimiento de Fontanel et al. (2002) por el medio de mantenimiento RD modificado del protocolo de Guiltinan et al. (2003), considerando que este contiene calcio, sulfuro y magnesio en una mayor concentración, y que dichos elementos son clave para un adecuado desarrollo de las hojas (Azcón y Talón, 2008).
Enraizamiento adventicio
En esta etapa se procedió a inducir raíces adventicias en las plántulas procedentes del medio RD debido a que la mayoría solo había desarrollado la raíz principal, aspecto que dificultaba el establecimiento ex vitro. De acuerdo con los trabajos realizados por Pruski et al. (2005) y Traore et al. (2003) se seleccionaron dos pulsos de IBA como los más adecuados para el desarrollo de raíces, 0.5mg/L y 0.5g/L cada uno aplicado durante 1 minuto. Se tuvo en cuenta un control en el que no se aplicó pulso de IBA. Un total de 67 plantas fueron usadas para este experimento. La metodología consistió en sumergir la parte radical de cada una de las plantas en la solución enraizadora por un minuto y, posteriormente, se sembraron en medio basal DKW libre de reguladores. Las condiciones de cultivo fueron las mismas de la etapa de maduración. El porcentaje de plantas enraizadas y el número de raíces por planta se registraron 45 días después de la aplicación del pulso.


Embriogénesis somática secundaria (ESS)
Embriones somáticos en estado globular y cotiledonar de un tamaño promedio de 1-4 mm (dependiendo del estado de desarrollo) se cortaron transversalmente y se sembraron en cajas de Petri (60x15mm) con 10 ml del medio de multiplicación CM2. Los cultivos permanecieron en oscuridad a una temperatura de 25ºC + 2ºC. El porcentaje de explantes formando embriones somáticos secundarios fue registrado 45 días después del cultivo en el medio CM2. Los embriones secundarios obtenidos se aislaron del callo madre y se subcultivaron en el medio MM6 para su conversión a plántula.
Análisis histológico
Con el objetivo de corroborar el carácter embriogénico de los callos y desarrollo normal de los embriones somáticos, se realizó un análisis histológico empleando explantes en diferentes estados de desarrollo. Estos fueron procesados siguiendo el protocolo de Maximova et al. (2002), modificado como se describe a continuación: Los embriones fueron fijados en paraformaldehído 2%, glutaraldehído 1% y cafeína 1% (w/v), deshidratados con series de alcohol 70% 60 minutos, 95% 15 minutos, 95% 30 minutos y 100% 15 minutos, seguidos por imbibición en parafina PARAPLAST (Ref 501006). El material embebido fue fraccionado en un micrótomo rotatorio (LEICA Model RM 2125) en secciones de 4 µm de grosor. Las secciones se colorearon siguiendo la técnica de tinción Safranina-Fast Green. El registro fotográfico se realizó en un microscopio de luz Carl Zeiss Primo Star.
Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados con el paquete estadístico SAS 9.1. Para los resultados de respuesta callogénica y enraizamiento se realizaron análisis categóricos. Para los datos obtenidos en la embriogénesis primaria y secundaria y maduración se realizó un análisis factorial. En las variables se determinó la media general con un nivel de confianza P < 0.05.
Resultados Desinfección

El protocolo de asepsia optimizado permitió obtener resultados promedios de desinfección del 85% para el clon ICS95 y del 96% para el clon BIOB, porcentajes considerados altos para genotipos cuya procedencia fue de campo, donde se reconoce que la carga microbiana es mayor que para plantas provenientes de invernadero.


Inducción y formación de embriones somáticos
Los explantes cultivados en los medios PCG e INDI incrementaron dos veces su tamaño original y posteriormente sobre su superficie se formó un callo compacto blanco granular. En ambos medios y variedades, la formación de callo fue mayor al 90% después de un mes de cultivo (figura 2a). Los embriones somáticos en estado globular fueron evidentes 15 días después del subcultivo en los medios SCG e INDExp, principalmente en las bases de pétalo para el clon ICS95 y exclusivamente en los estaminodios para el clon BIOB. Sin embargo solo los embriones del clon BIOB alcanzaron la etapa cotiledonar. Los embriones del clon ICS95 se formaron en la superficie del callo blanco compacto (Figura 2b), en tanto que embriones independientes o agrupados (clusters) del clon BIOB se formaron a partir de un callo granular café de textura friable (Figura 2c y 2d). Para el clon BIOB, el número de embriones independientes por explante y el de clusters formados por explante, arrojaron una media de 3 y 15 respectivamente, obteniéndose la máxima producción dos meses después del subcultivo (tabla 2).
Tabla 2. Respuesta embriogénica en los genotipos de cacao ICS95 y BIOB. aNo.P. de ES: Número promedio de embriones somáticos.

Genotipo




ICS95

BIOB

Explante

Pétalo

Estaminodio

Callo (%)

90

92.78

Callo embriogénico (%)

50

32.81

No.P. de ESa/Explante

1.5

3.079

No.P. de cluster/explante

0

15.11




Figura 2. Respuestas callogénica y embriogénica en los clones evaluados. a) y b) clon

ICS95. c) y d) clon BIOB.




Maduración
Los embriones somáticos del clon BIOB, 45 días después de ser transferidos al medio MM6, alcanzaron una altura no superior a un centímetro, un número de hojas inferior a 2 y solo iniciaron la formación de la raíz principal. Cuando las plantas se subcultivaron en el medio de mantenimiento, el enraizamiento, altura y número de hojas no mejoraron, por el contrario las plantas perdieron vigor y algunas se tornaron necróticas, lo cual fue indicativo de una baja respuesta respecto a lo reportado para el protocolo en otras variedades.
Teniendo en cuenta que el tiempo de respuesta contemplado en este protocolo puede ser corto para los procesos de desarrollo en plantas leñosas como el cacao, se evaluó la transferencia a medio fresco MM6 cada 30 días durante dos meses adicionales. La permanencia por más de 45 días en este medio favoreció el vigor de las plántulas reflejado en la altura (1.44 + 0.94 cm), número de hojas (2.40 + 1.41) y porcentaje de plantas enraizadas (91.23%) (figura 3a). Las plantas de 3-4 cm de altura se adaptaron a condiciones ex vitro sin necesidad de un subcultivo previo en el medio de mantenimiento como lo describe el protocolo original de Fontanel et al. (2002). El porcentaje de conversión a plántula fue del 68,42 y el de establecimiento ex vitro fue del 66% (figura 3b).
Para el clon ICS95, teniendo en cuenta que los embriones formados en el medio INDExp solo alcanzaron la etapa globular, se procedió a evaluar de acuerdo con la literatura disponible el Ácido Abscísico (ABA) y diferentes concentraciones de sacarosa, con miras a mejorar el proceso de maduración de estos embriones (Alemanno et al., 1997, Fang et al., 2004). Los resultados de estos ensayos no mostraron un mejoramiento del proceso de maduración y desarrollo de los embriones somáticos, los cuales, por el contrario, formaron un callo blanco granular en su superficie (dato no mostrado).



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