Разработка систем генетической паспортизации лиственных пород Populus, Salix, Betula




Дата канвертавання25.04.2016
Памер43.04 Kb.
Разработка систем генетической паспортизации лиственных пород (Populus, Salix, Betula) на основе ядерных микросателлитных маркеров
Политов Д.В.1, Белоконь М.М.1, Белоконь Ю.С. 1, Полякова Т.А. 1, Шатохина А.Н. 1,

Мудрик Е.А. 1, Азарова А.Б.2, Филиппов М.В. 2, Шестибратов К.А. 2,



1Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Россия, dmitri_p@inbox.ru

2 Филиал институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Россия
Разработка универсальных тест-систем генетической паспортизации лиственных древесных пород и внедрение их в практику лесного хозяйства является важной актуальной задачей, отвечающей вызовам, стоящим перед лесным хозяйством в связи с его интенсификацией и широким развитием плантационных подходов. Одной из решаемых проблем является осуществление контроля идентичности клонально (в том числе микроклонально) размножаемых элитных генотипов, и, таким образом, обеспечение генетической чистоты клоновых плантаций. Среди имеющихся классов генетических маркеров наиболее полно отвечают этим задачам ядерные микросателлитные локусы, характеризующиеся специфичностью, воспроизводимостью, кодоминантностью, полиаллельностью, высокой гетерозиготностью, кроме того, они не требуют сложного оборудования для анализа. Для осины, березы и ивы тест-систем, обеспечивающих решение задач генетической идентификации, в России в настоящее время нет. Для первичного тестирования генотипов осины (Populus tremula) были отобраны 33 микросателлитных локуса, разработанные исходно для двух видов тополей: P. nigra (Smulders et al., 2001) и Populus trichocarpa (Tuskan et al., 2004). Данные локусы содержат повторы от трех до шести нуклеотидов при длине ампликона от 120 до 250 пар нуклеотидных оснований, что делает их удобными для анализа с помощью стандартного вертикального электрофореза в блоках полиакриламидного геля. Тестирование проводили на образцах ДНК осины из четырех природных популяций (Московской, Воронежской, Новосибирской областей и Красноярского края), а также на образцах клонов элитных генотипов осины из культуры in vitro. По результатам тестирования 20 локусов оказались изменчивыми с числом аллелей от двух до четырнадцати. Амплификация еще четырех локусов прошла успешно, но они оказались мономорфными во всех популяциях. Не было получено продуктов амплификации девяти локусов, вероятно ввиду отсутствия или изменения сайтов узнавания праймеров. Наиболее предпочтительными для использования в целях генетической идентификации образцов являются локусы с большим числом аллелей и высокой средней гетерозиготностью. Полученные результаты позволили создать тест-систему на основе 14 высокополиморфных локусов, позволяющих с высокой вероятностью установить соответствие тестируемого генотипа эталонной клоновой линии. Система допускает случайное совпадение двух неродственных генотипов с вероятностью 3х10-13, и 1х10-5 в случае возможности происхождения исследуемых образцов от общих предков. Тест-система генетической идентификации элитных гаплотипов березы (Betula pendula, B. pubescens) была создана на основе тестирования 30 микросателлитных локусов, разработанных для различных представителей семейства Betulacea (Gurcan and Mehlenbacher, 2010; Kulju et al., 2004; Truong et al., 2005; Tsuda et al., 2009). Тестирование проводили на образцах ДНК березы пушистой из природных популяций (Якутия), а также на образцах клонов березы повислой и березы пушистой из культуры in vitro. По результатам тестирования 28 локусов оказались изменчивыми с числом аллелей от двух до двенадцати и ожидаемыми длинами ампликонов. Дальнейшее тестирование микросателлитов березы на природных популяциях необходимо для рекомендации внедрения тест-систем в лесохозяйственную практику. Для разработки тест-системы генетической идентификации элитных генотипов ив рода Salix были отобраны 23 микросателлитных локуса, разработанные для изучения генетической изменчивости ив (Barker et al., 2003; King et al, 2010), а также девять локусов, изначально разработанных для тополей (Tuskan et al., 2004). Тестирование проводили на образцах ДНК ив белой (Salix alba) и ломкой (S. fragilis) из природной популяций Московской обл.), а также на образцах клонов ив ломкой, козьей (S. caprea) и пурпурной (S. purpurea), микроклонально размножаемых в культуре in vitro. По результатам тестирования 22 локуса, разработанные для представителей рода Salix, оказались изменчивыми с числом аллелей от двух до семи. По небольшого числа локусов у некоторых видов отмечалось отсутствие в некоторых образцах амплифицированных фрагментов. Из 9 локусов, разработанных для тополей, только один локус давал стабильную амплификацию на ивах, по нему был обнаружен полиморфизм. Разработанные тест-системы могут быть использованы для идентификации элитного клонально размноженного (а также любых иных видов) посадочного материала осины, тополей, берез и ив с высокой точностью, надежностью, обеспечивая низкую вероятность случайного полного совпадения индивидуальных генетических профилей. Тест-системы применимы и иных практических целях в лесном хозяйстве, где требуется индивидуальная идентификация.

Работа выполнялась в рамках Соглашения № 14.607.21.0044 от «22» августа 2014 г. по проекту «Клеточная селекция и микроклональное размножение элитного посадочного материала для создания быстрорастущих генетически маркированных лесных плантаций».


Development of Systems for Genetic Passportization of Forest Trees (Populus, Betula, Salix) Based on Nuclear Microsatellite Markers
Politov D.V.1, Belokon M.M.1, Belokon Yu.S.1, Mudrik E.A.1, Polyakova T.A.1,

Shatokhina A.V.1, Azarova A.B.2, Filippov M.V.2, Shestibratov K.A.2,



1 Vavilov Institute of General Genetics RAS, Moscow, Russia, dmitri_p@inbox.ru

2 Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Pushchino Branch, Pushchino, Russia
Development of universal test systems for genetic passportization of foliage forest trees and their application is an important task meeting various challenges of forestry practice in view of its intensification and introduction of plantation approach. One goal is to achieve identity control for clonally (and microclonally) propagated elite genotypes, and ensuring purity of composition of clonal plantations. Among available genetic markers, nuclear microsatellite loci are the most suitable for this purpose due to their specificity, reliability, co-dominance, multiple allelic content, high heterozygosity, and convenience of application. For initial testing of aspen (Populus tremula) genotypes 33 heterologous microsatellite loci designed for P. nigra (Smulders et al., 2001) and P. trichocarpa (Tuskan et al., 2004) have been selected. These loci contain repeat motifs (3-6 bp) and are sized between 120 and 250 bp that makes them suitable for resolution using standard cells for vertical polyacrylamide electrophoresis. Testing was done on DNA extracted from elite aspen clones (from in vitro culture) aimed for establishment of highly productive forest plantations and on population samples of wild aspen from Moscow, Voronezh, Novosibirsk regions and Krasnoyarsk Krai. 20 loci were variable with allele numbers from two to 14. Four more loci demonstrated consistent amplification but were monomorphic in all studied samples. For nine loci no PCR product were obtained, putatively due to mutation in annealing sites. Fourteen loci with stable amplification and relatively high allelic and genic variability were selected for inclusion in the test system «Osina-M». Application of the test system on the available clones and reference wild trees ensured effective and reliable identification of individual plants by their multi-locus microsatellite genotypes. The test system assures accidental identity of two unrelated genotypes with probability 3х10-13, and 1х10-5 in case of probable relatedness of the two specimens compared. A test system for identification of elite haplotypes of birch (Betula pendula, B. pubescens) was developed by testing of a set of 30 microsatellite loci designed for different species of family Betulacea (Gurcan and Mehlenbacher, 2010; Kulju et al., 2004; Truong et al., 2005; Tsuda et al., 2009). Testing was performed through genotyping of plants of wild population of B. pubescens from Republic of Sakha (Yakutia), and then on elite clones of B. pendula and B. pubescens from in vitro cultures. After testing, 28 loci were shown to be variable having from two to twelve alleles per locus and expected amlicon length. Further testing of birch microsatellites on native populations is needed for recommendation of the test systems for forestry practice. For development of test system of genetic identification of elite haplotypes of willows (genus Salix) 23 microsatellite loci have been selected (Barker et al., 2003; King et al, 2010), along with nine loci designed initially for poplars (g. Populus) тополей (Tuskan et al., 2004). These markers were tested on DNA samples from Salix alba and S. fragilis from natural populations of Moscow region, and on selected elite genotypes of S. fragilis, S. caprea, and S. purpurea microclonally propagated via in vitro culture. Among the loci designed initially for willows 22 loci were variable with two to seven alleles. For some loci in some species we observed absence of PCR products. Out of nine loci designed initially for poplars, only one locus demonstrated consistent amplification and was polymorphic. The developed test systems can be used for identification of elite and any other genotypes of aspen, birch and willow with high fidelity, reliability ensuring low probability of complete accidental matching of individual genetic profiles. These tools are also applicable for other goals in forestry where individual identification is required.

The research was supported by Agreement № 14.607.21.0044 of 22 August 2014 for the project ''Cell selection and microclonal propagation of elite material for establishment of fast growing genetically marked forest plantations''.


База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка