На правах рукописи




Дата канвертавання26.04.2016
Памер304.73 Kb.

На правах рукописи

ПЕРШИКОВА НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА

Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных

16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2008

Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии
Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук

старший научный сотрудник

Донченко Николай Александрович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Глотова Татьяна Ивановна


доктор ветеринарных наук, профессор

Ощепков Владимир Григорьевич


Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследо-

вательский институт пантового

оленеводства СО Россельхозакадемии

Защита состоится «__»___________2008 г. в «__» ч. на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, СО Россельхозакадемия, ИЭВСиДВ.


С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии
Автореферат разослан «__»__________2008 г.



Учёный секретарь

диссертационного совета, к.в.н. Г.М. Стеблева
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важным элементом в диагностике туберкулёза сельскохозяйственных животных является быстрая, чувствительная и специфическая идентификация этиологического фактора. Однако, так называемые, атипичные микобактерии усложняют постановку окончательной дифференциальной диагностики туберкулёза (А.И. Каграманов, 1964). Атипичные микобактерии, обитающие в окружающей среде и персистирующие в организме животных, сенсибилизируют его к ППД туберкулину для млекопитающих, что объясняется их антигенным родством с возбудителем туберкулёза (Ю.Я. Кассич, 1990). В результате чего затрудняется профилактический контроль благополучия стад крупного рогатого скота при проведении внутрикожной туберкулиновой пробы (Р.В. Костюк., 2004; А.Х.Найманов и др., 2004). При проведении эпидемиологического и эпизоотологического контроля различных инфекций, включая туберкулёз, важное место приобретают молекулярно-генетические данные (Г.Д. Каминский и др., 1989; В.В. Макаров и др., 1991).

Для получения эпизоотологически значимых результатов необходимо проводить сравнение генетических данных, полученных в ходе исследования разных популяционных групп. Однако знание молекулярной вариабельности генома микобактерий только в одной группе носителей даёт недостаточно полные объективные данные для уточнения эпизоотической ситуации, но сравнение генетических структур популяций инфекционного патогена, выявленных на различных территориях, в разное время или у различных групп носителей, что может стать ключом к пониманию эволюционной истории микобактерий. Это позволит не только уточнить текущее разнообразие микобактериальных изолятов, циркулирующих в организме крупного рогатого скота, но и выделить исторические этапы эпизоотического процесса.

Цель исследования – изучить генетический полиморфизм и особенности филогенетических и популяционных взаимоотношений популяции микобактерий, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных (на территории Новосибирской области) при помощи молекулярно-генетических методов исследования.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ПЦР, определить её чувствительность и специфичность. Тестировать референтные штаммы и изоляты микобактерий.

2. Изучить генетический полиморфизм культур, изолированных от животных, а также из объектов окружающей среды и грызунов благополучных и неблагополучных по туберкулёзу хозяйств.

3. Определить степень сходства изолированных культур микобактерий внутри изучаемой видовой выборки и в сравнении с прототипными штаммами.

Научная новизна. Разработана диагностическая ПЦР, использующая в качестве мишени mig-ген M.avium, систему senX3-regX3 для дифференциации M.tuberculosis от M. bovis. Изучено генетическое разнообразие микобактерий. Получены данные по нуклеотидным последовательностям фрагмента mig-гена M. avium и системы senX3-regX3 M. tuberculosis complex. Определена степень сходства микобактерий с использованием популяционного и филогенетического методов исследования. Впервые от свиней на территории России выделен потенциально новый вид микобактерий M. arupense.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, поскольку позволяют расширить научные знания о генетическом полиморфизме и популяционных характеристиках микобактерий, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных и могут быть использованы при проведении дифференциально-диагностических исследований на туберкулёз, а также при изучении молекулярной эпизоотологии болезни.

Проведены подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для детекции и дифференциации M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, а также атипичных микобактерий. Доказана их эффективность для видоспецифичной экспресс-диагностики туберкулёза и проверена на ДНК 95 штаммов и изолятов различных видов микобактерий.

Материалы диссертации использованы при составлении двух методических рекомендаций «Использование полимеразной цепной реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами для определения видовой принадлежности микобактерий», (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 4, 2007) и «Применение ДНК-маркеров при генетическом картировании культур Mycoplasma species, Fusobacterium neccrophorum и Mycobacterium avium», (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 1, 2008 г.).

Апробация работы. Результаты работы доложены на заседаниях Учёного совета ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии (Новосибирск, 2003 – 2007 гг.), на научн.-практич. конф. «Информационные технологии, информационные измерительные системы и приборы в исследовании сельскохозяйственных процессов», (Новосибирск, 2003), II-й международ. научн.-практич. конф. молодых учёных (Новосибирск, 2006), на Российской науч.-практич. конф., посвящённой 110-летию кафедры инфекц. болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург,2006), междунар. конф. молодых учёных (Омск, 2006 г), III Российской науч. конф. с международ. участием (Новосибирск, 2006), международ. конф. «Молекулярная биология 2007» (Москва, 2007).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ («Сибирский вестник с.-х. науки»).

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, выводов и списка литературы, включающего 190 источников, из них 108 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 20 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты подбора и тестирования олигонуклеотидных праймеров, используемых в ПЦР для выявления ДНК микобактерий.

2. Результаты изучения фрагмента гена 16S-23S рРНК потенциально нового вида микобактерий M. arupense.

3. Результаты изучения генетического полиморфизма, филогенетических и популяционных характеристик, выделенных изолятов как внутри группы, так и в сравнении с прототипными штаммами.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы
Работа выполнена в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулёзом сельскохозяйственных животных ГНУ ИЭВС и ДВ СО Россельхозакадемии и на базе Института молекулярной биологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу сельскохозяйственных животных проводили на основе отчетных данных Управления ветеринарии Администрации по Новосибирской области за период с 2000 по 2007 годы. В исследованиях использованы референтные штаммы, депонированные и предоставленные Федеральным Государственным учреждением Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов и культуры, изолированные от больных туберкулёзом и реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих животных, а также из объектов окружающей среды. Отбор, подготовка проб, постановка биопробы на лабораторных животных (морские свинки, кролики) и биохимические тесты проводили согласно «Наставлению по диагностике туберкулёза животных» (М., 2002).

Поступивший в лабораторию биоматериал обрабатывали по методу А.П. Аликаевой и Гона-Левенштейна-Сумиоши. При окончательной постановке диагноза учитывали клинические признаки инфицированных животных и эпизоотологические данные хозяйств, откуда был завезён биоматериал. Выделение суммарной ДНК микобактерий из клинических образцов осуществляли методом фенольно-хлороформной экстракции (Т. Маниатис и др., 1984; А.В. Мазин и др., 1990) с предварительной обработкой лизирующим буфером. ДНК из чистых культур выделяли с применением сорбции на силикагеле с использованием набора ДНК-сорб (ЦНИИЭ). Всего исследовано 95 образцов ДНК различных видов микобактерий. Последовательности праймеров (табл. 1) заимствованы из источников литературы (J. Magdalena et al., 1998; M.L. Beggs et al, 2000; T. Adekambi et al., 2006; E. Alix et al, 2006; L. Xiong et al., 2006).
Таблица 1- Праймеры для амплификации генома микобактерий.

Назва

ние


Вид микобактерий

Ген-мишень

Последовательность

3575

3576

M.tuberculosis

mgtC


5´-CGCCTAGGCTCAAACTGCTG-3´

5´-CAATACCCGGCGGATCTACC-3´



3573

3574

M.fortuitim

rpoB


5´-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3´

5´-AGCGGCTGCTGGGTGATCATC-3´



2727

2728

M.avium


mig-gene

5´-CCCGTTCAACGTCAACTTCC-3´

5´-GGGCTCGCCGGTCATCAGGT -3´



3607

3608

M. tuberculosis complex

senX3-regX3



5´-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3´

5´-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3´



3571

3572


Mycobacterium spp.

16S-23S rRNA

5´- ACCTCCTTTCTAAGGGCACC-3´

5´- GATGCTCGCAACCACTATTCA-3´



В качестве маркеров выбраны: mig-gene, отвечающий за вирулентность M.avium, область senX3-regX3, характерная для M. tuberculosis complex, mgtC, отвечающий за вирулентность M.tuberculosis, 16S-23S rRNA – спейсерная последовательность для индикации всех видов типичных и атипичных микобактерий. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл буфера для Tag-ДНК-полимеразы, 2,5 мкл mM dNTP mix, по 2,5 мкл каждого праймера с концентрацией 2 mM, 2,5 ед. активности Tag-ДНК-полимеразы, 5 мкл ДНК. Поверх реакционной смеси наслаивали 20 мкл минерального масла.

Постановку ПЦР осуществляли по общепринятым методикам на амплификаторе «Терцик» (А.Б. Вартапетян, 1991; Т.Д. Гришина и др., 1995; Б. Глик, Дж. Пастернак, 2002). Анализ, полученных в ПЦР данных, проводили методом электрофореза в агарозном геле. В качестве маркера использовали pUC19/Kzo9 I и pBluescript/Msp. Результаты электрофореза учитывали в УФ-свете на трансиллюминаторе с длиной волны 254 нм. Определение первичной нуклеотидной последовательности проводили на автоматическом секвенаторе «Beckman CEQ2000XL» («Beckman Coulter», США) cогласно инструкции производителя. Популяционный анализ осуществляли с использованием программ MEGA 3.1. (PSU, США) и GeneDoc 2.6. методом «ближайших соседей». Для построения дендрограммы использовали фрагменты нуклеотидных последовательностей микобактерий, депонированных в международной базе данных GenBank. Обработка последовательностей проводилась с использованием специализированных программных пакетов MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США). Дендрограммы построены на MegAlign 4.04. из пакета программ DNASTAR, Inc., Madison, USA. Для статистической обработки данных при оценке достоверности группирования применяли бутстреп-тест (Felseinstein, 1985).

Автор выражает благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации к.б.н., сотруднику Института молекулярной биологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Терновому В.А..
2.2. Результаты исследований


      1. Анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу в хозяйствах Новосибирской области (2000 – 2007 гг.)

По данным статистической ветеринарной отчётности, в Российской Федерации за последние 15 лет наблюдается устойчивая положительная динамика снижения количества неблагополучных пунктов (как вновь выявляемых, так и остающихся на конец года) и количества заболевших туберкулёзом животных. Новосибирская область до настоящего времени ещё остаётся неблагополучной по туберкулёзу крупного рогатого скота, хотя и наблюдается тенденция к снижению заболеваемости животных. Так, на конец 2007 года было зарегистрировано 12 неблагополучных пунктов против 18 в 2000 году (рис. 1). Также произошло снижение реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих животных (с 5110 гол. в 2000 году до 1904 гол. в 2007). В биоценозах таких территорий была установлена циркуляция атипичных микобактерий: M. avium, M. smegmatis, M. phlei, M. arupense, M. terrae, M. fortuitum.



Рисунок 1 - Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу КРС в хозяйствах Новосибирской области




      1. Микробиологическая характеристика исследуемой выборки изолятов микобактерий

С использованием вышеописанных методов исследовано 4 пробы, отобранные из объектов внешней среды (почва, вода, навоз, корма и т.д.), 88 проб биоматериала от крупного рогатого скота и свиней, а также биоматериал – от 3 птиц. Из данного биоматериала 10 (10,5 %) изолятов были идентифицированы как типичные микобактерии туберкулёза (4 – M.bovis, 6 – M. tuberculosis) и 85 (89,5 %) – атипичные микобактерии, из которых 2 относились к I группе по Раньону, 9 - ко II, 34 - к III и 20 - к IV группе по Раньону. Остальные пробы биоматериала неидентифицированы. 4 изолята, выделенные из почвы выгульной площадки, принадлежали к IV группе по Раньону. Из биоматериала, взятого от птиц в 2-х случаях микобактерии отнесли к III группе по Раньону. Один изолят остался недифференцированным (табл.2). 21 изолят, выделенный из биоматериала от реагирующих на туберкулин животных, идентифицировали до вида, из них 11 были определены как M. avium, 4 - как M. tuberculosis и 6 - как M. bovis.

Таблица 2 - Культуры микобактерий, изолированные из биоматериала от животных и объектов внешней среды

Вид животных, исследованный материал

Вид микобактерий

Типичные микобактерии

I группа

II группа

III группа

IV группа

Атипичные,

неидентифицированные



Крупный рогатый скот

10

1

5

4

16

15

Свиньи

-

1

-

28

4

4

Птицы

-

-

-

2

-

1

Почва, вода, навоз, корма

-

-

4

-

-

-

Всего

10

2

9

34

20

20

В результате работы с указанными изолятами сформирован лабораторный банк ДНК микобактерий.


2.2.3. Подбор и тестирование праймеров для постановки ПЦР. Параметры ПЦР

Последовательности праймеров были заимствованы из опубликованных источников и протестированы на референтных штаммах (J. Magdalena et al., 1998; M.L. Beggs et al, 2000; T. Adekambi et al., 2006; E. Alix et al, 2006; L. Xiong et al., 2006). В результате для работы были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие последовательности mig-гена, rpoB-гена, спейсерной последовательности 16S-23S rRNA и система senX3-regX3. Для проведения достоверной амплификации ДНК варьировали температуру отжига и количество циклов ПЦР. При этом для каждой пары праймеров были подобраны оптимальные условия проведения реакции и вычислены следующие режимы амплификации:

-для выявления M. tuberculosis - 95°С × 5 мин (1 цикл), 95°С × 30 сек, 50°С × 30 сек, 72°С × 1 мин (40 циклов), 72°С × 5 мин. При использовании такого режима амплификации получали искомый фрагмент в 80 п.н.;

-для выявления M.fortuitum - 94°С × 5 мин (1 цикл), 94°С × 1 мин, 60°С × 1 мин, 72°С × 1 мин (25 циклов), 72°С × 10 мин. При использовании такого режима амплификации получали искомый фрагмент в 700 п.н.

-для выявления M.avium complex - 95°С × 5 мин (1 цикл), 95°С × 30 сек, 68°С × 2 мин, 72°С × 5 мин (30 циклов), 72°С × 4 мин. При использовании такого режима амплификации получали искомый фрагмент в 373 п.н.;

-для выявления M. tuberculosis complex - 94°С × 5 мин (1 цикл), 94°С × 1 мин, 60°С × 1 мин, 72°С × 1 мин (25 циклов), 72°С × 10 мин. При использовании такого режима амплификации получали искомый фрагмент в 543 п.н.;

-для выявления Mycobacterium spp. - 96°С × 5 мин (1 цикл), 94°С × 30 сек, 60°С × 30 сек, 72°С × 1 мин (35 циклов), 72°С × 10 мин. Размеры ампликонов варьировали от 200 пн до 320 пн.


        1. Специфичность и чувствительность ПЦР для выявления ДНК микобактерий

С целью выяснения специфичности ПЦР было проведено выделение ДНК по одной и той же методике из референтных штаммов микобактерий и штаммов E. coli, Staphylococcus albus и Citrobacter frendii. Затем поставили ПЦР с ранее отработанными режимами амплификации. Из полученных результатов (табл. 3) следует, что положительные анализы продуктов ПЦР были получены только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК типичных или атипичных микобактерий. Анализы были отрицательными, когда в качестве матрицы использовали ДНК E. coli, Staphylococcus albus и Citrobacter frendii.


Таблица 3 - Результаты испытаний на специфичность ПЦР для выявления ДНК микобактерий


Микроорганизмы

Методы исследования


Mig-ген

16S-23S

rRNA


senX3-regX3

Бак. посев


Mycobacterium spp.

+

+

+

+

E. coli

-

-

-

-

Staphylococcus albus

-

-

-

-

Citrobacter frendii

-

-

-

-

Примечание: «+» - положительный результат

«-» - отрицательный результат.

При определении специфичности системы senX3-regX3, дифференцирующей M. tuberculosis от M. bovis, в реакциях с использованием ДНК различных видов микобактерий (M. bovis, M. tuberculosis, M. smegmatis, M. avium, M. kansasii) специфичные ампликоны размерами 329 и 406 п.н. соответственно были получены только с ДНК M. tuberculosis и M. bovis.

При ПЦР на район mig-гена специфичный ампликон синтезировался только со штаммами M. avium, при этом реакция с M. intracellulare была отрицательной, что подтверждает специфичность данного маркера. При постановке реакции на участок mig-гена продуцировался фрагмент размером 373 п.н.

При амплификации образцов ДНК с праймерами на спейсерную последовательность 16S-23S rRNA синтезировался один фрагмент для всех микобактериальных изолятов длиной от 200 до 320 п.н. Ампликоны медленно-растущих видов микобактерий были в пределах 200 – 250 п.н. M. xenopi продуцировал продукт длиной 200 п.н., а M. gilvum – длиной 320 п.н. Расчёт концентрации ДНК осуществляли по Т. Маниатис, Э.Фрич, Д. Сэмбрук, 1984. Чувствительность ПЦР составила не менее 12 пг ДНК в 1 мкл.
2.2.3.2. Тестирование при помощи ПЦР референтных штаммов микобактерий
Результаты тестирования референтных штаммов представлены в таблице 4. Согласно полученным данным, ПЦР с используемыми парами праймеров выявляет ДНК всех исследованных штаммов микобактерий, тестированных микробиологическими и биохимическими методами.

Таблица 4 - Амплификация ДНК штаммов микобактерий в ПЦР с выбранными праймерами



№ ПП

Наименование штаммов

Амплификация в ПЦР

1-4

M. tuberculosis str. Erdmann

+

5-7

M. bovis str. 8

+

8-12

M. avium

+

13-16

M. fortuitum, M. kansasii

+

2.2.3.3.Тестирование при помощи ПЦР изолятов микобактерий

Реакция с системой senX3-regX3 показала положительные результаты с двумя (2,1 %) изолятами M. tuberculosis и подтвердила их микробиологическую характеристику.

При постановке ПЦР фрагмент mig-гена, характерный для M. avium, был обнаружен в 60 (63,2%) образцах, первоначально охарактеризованных как III-IV группа по Раньону и неидентифицированные атипичные микобактерии. На рис. 2 приведена картина электрофореза продуктов амплификации (фрагмент mig- гена, равный 373 п.н.), свидетельствующая о наличии ДНК M. avium.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рисунок 2 - Электрофореграмма фрагмента mig-гена M. avium.

1 – маркер молекулярного веса (MspI, гидролизат плазмиды pUC19); 2 - M. smegmatis, №3 - 10-06, № 4 - 48-01, №5 - 26-06, №6 - 14-05, №7 - 30-04, №8 - 18-06, №9 – M. fortuitum, №10 – M. tuberculosis, № 11 - 8-03, № 12 – 31-03, №13 – маркер молекулярного веса.
27 (45%) изолятов были выделены от крупного рогатого скота, 30 (50%) – от свиней и 3 (5%) изолята – от птиц. При этом первоначально 5 изолятов M. avium охарактеризованы как типичные возбудители туберкулёза, вызывая у лабораторных животных характерную клиническую и патологоанатомическую картину туберкулёза. При культивировании на плотной питательной среде фенотипически указанные изоляты проявляли свойства типичные для этого вида микобактерий. 9 изолятов (9,5 %), типированные как II группа по Раньону, принадлежали к M. phlei и были изолированы от крупного рогатого скота. 6 (6,3 %) изолятов показали положительный результат с праймерами, фланкирующими участок rpoB-гена, используемыми для идентификации M. fortuitum. 5 изолятов M. fortuitum были выделены из биоматериала от крупного рогатого скота и 1 - свиней. Остальные 18 (18,9%) изолятов были идентифицированы как Mycobacterium spp.
2.3. Генотипирование микобактерий

2.3.1. Определение нуклеотидной последовательности

Выделение продукта амплификации из ПААГ после проведения электрофореза осуществляли методом пассивной элюции с последующей очисткой от компонентов элюирующего буфера и осаждением.

Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР фрагмента проводили на «Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System» («Beckman Coulter, Inc.»), согласно инструкции к «Beckman sequencing Kit».

Для проведения реакции в 0,5 мл пробирках смешивали по 1 мкл раствора праймера с концентрацией 3 о.е./мл, 3 мкл раствора исследуемой ДНК и 6 мкл DTCS (содержит компоненты реакционного буфера, дезоксинуклеозидтрифосфаты, меченные флуоресцентными красителями дидезоксинуклеозидтрифосфаты, термофильную полимеразу). Суммарный объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Реакцию проводили в следующем режиме: Т=950С, 20 секунд; Т=500С, 20 секунд; Т=720С, 1 минута; 40 циклов. После завершения последнего цикла в пробирки добавляли по 2 мкл стоп-реагента (100 мМ EDTA, 3 M NaOAc 1:1) для остановки реакции. Осаждение продуктов реакции из полученной смеси проводили, добавляя по 30 мкл охлажденного 96% этанола, в присутствии соосадителя (гликоген, входящий в состав набора). Смесь перемешивали встряхиванием и центрифугировали 15 минут при 14000 g, супернатант отбирали, осадок промывали 100 мкл охлажденного 70% этанола. Осадок подсушивали в открытых пробирках при комнатной температуре в течение 10 минут, растворяли в 20 мкл раствора для нанесения образцов из набора для секвенирования, после чего осуществляли разделение образцов. Обработку результатов секвенирования проводили при помощи пакетов программ CEQ 2000, Vector NTI и GENEDOC.

Для филогенетического анализа были выбраны образцы материала, полученного от животных из удалённых друг от друга районов.
2.3.2. Генотипирование изолятов M. arupense и M. terrae

При анализе изолята, выделенного от свиньи получены фрагменты ДНК в количестве, достаточном для прямого определения нуклеотидной последовательности фрагмента 16S-23S рРНК, идентифицированный при секвенировании как M. arupense. На вскрытии в лимфатических узлах у исследованного животного были обнаружены очаги с кашеобразным содержимым, размером с просяное зерно, кровоизлияния и стёртость между слоями органа. С аналогичной паткартиной в Японии впервые были зафиксированы случаи выделения M. arupense от человека (T. Masaki et al, 2006). В Африке M. arupense был изолирован от грызунов и насекомых видов C. gambianus, Mastomys natalensis and C. hirta (Durnez L et al., 2007). Эти факты подтверждают высокую тропность M. arupense к организму человека, домашних животных, грызунов и насекомых, а также их роль в распространении этого вида микобактерий в природных очагах болезни.

У западно-сибирского изолята M. arupense имеются нуклеотидные замены, отличающие его от прототипных штаммов. При построении дендрограммы M. arupense образовал 3 кластера с прототипными штаммами, зарегистрированными ранее в GenBank, которые, в свою очередь, объединяют несколько мелких ветвей. Наибольшую гомологию этот вариант имеет со штаммом M. arupense, изолированным и описанным в Италии в 2003 году (Тортолли и Мариотини). При тестировании процедурой бутстрепа M. arupense образовывал один клад с сибирским изолятом, имея коэффициент подобия 95%. Однако для западно-сибирского варианта M. arupense характерны аминокислотные замены в следующих паттернах: NCQ→NRQ, GLF→GQL, PLC→PLV.

Среди изучаемой выборки был получен изолят M. terrae, выделенный из почвы выгульной площадки животных и генетически близкий штамму, полученному в Китае. Несмотря на то, что прототипные штаммы являются более древними, западно-сибирский изолят M. arupense претерпел некоторые генетические изменения. В сравнении с прототипным штаммом, западно-сибирский вариант M. terrae имеет аминокислотные замены в следующих паттернах: VLQ→NLR, TTT→TAT, SLI→ALI, INC→TNR. При построении ML-дерева изолят M. terrae образовывал один кластер со штаммами M. tеrrae Восточно-Азиатской части материка, имея при этом индивидуальную ветвь.


2.3.3. Генотипическое разнообразие M. avium

Среди идентифицированных изолятов M. avium удалось выделить достаточное количество фрагментов ДНК для 19 проб. Из них в 3 пробах определена последовательность спейсера 16S-23S рРНК. Для оставшихся проб секвенирован фрагмент последовательности mig-гена, отвечающего за вирулентность M. avium. Полученные данные показывают, что фрагмент нуклеотидной последовательности mig-гена (118 – 165 п.н.) изолята 31-03 содержит уникальную нуклеотидную замену, которая находится в положении 142 (CAT→CCT). Изоляты 31-03 и 10-06 имеют уникальные аминокислотные замены, находящиеся в одинаковых позициях: DSE→DYE, PRL→PGL, DES→DKS. В сравнении с прототипным штаммом MAU43598 22 клинических изолята M. avium Сибирского региона имеют характерные нуклеотидные замены в положении 130 п.н. (AGC→ACC), 233 п.н. (GCA→GGA), 241 п.н. (CCA→CCG) и 343 п.н. (CAT→CGT) фрагмента mig-гена. Последовательность изолята 40 (изолят 24-03) наиболее близка последовательности изолята EF642999, выделенного в США в 2007 году и группируется вместе с ним в составе клады, образованной западно-европейскими штаммами M. avium, выделенными на территории США и Германии. Коэффициент подобия составил 96%. Популяционные взаимоотношения между изолятами M. avium представлены на рис. 3.



Рисунок 3 – Популяционные взаимоотношения между изолятами M. avium

Аминокислотные последовательности 3 изолятов M. avium, выделенных в сибирском регионе имеют значительную степень гомологии c аминокислотной последовательностью изолята M. avium subsp. paratuberculosis K10. Данный подвид микобактерий комплекса M. avium является этиологическим фактором болезни Крона крупного рогатого скота и имеет >3,000 генов, гомологичных возбудителю туберкулёза человеческого вида (Li L., Bannantine J.P., Zhang Q., 2005).




        1. Полиморфизм mig-гена M. avium

С помощью программы AlignX было вычленено два высококонсервативных локуса mig-гена (1 – 60 н. и 160 – 170 н.). Расчёты антигенного индекса по Jameson – Wolf показали, что первый локус упакован внутри белковой молекулы и поэтому не выполняет функцию антигена. Можно предположить, что он выполняет функцию коровой структуры белка, определяющей конформацию отдельных доменов молекулы. Это подтверждает тест Surface Probability Plot – Emini.

При использовании расчётов по Gamier-Robson вышеупомянутый локус относится к участку α-спирали этого белка. Однако, расчёты по Chou – Fasman отрицают это. И мы более склоны относить этот локус к Tum-региону (по Chou – Fasman).

Второй высококонсервативный локус, напротив, отличается высоким содержанием гидрофильных кислот, что подтверждает Surface Probability Plot – Emini. Он обладает высоким антигенным индексом по Jameson – Wolf.

Помимо высокой антигенной значимости по Karplus – Schulz он относится к подвижному участку белковой молекулы.
2.3.4. Генотипирование M. smegmatis
При популяционном анализе изолята Mycobacterium avium, полученного в 2006 году от крупного рогатого скота нуклеотидные последовательности сформировали 2 кластера с двумя подкластерами каждая. Генетически близким был определён M. avium str. 104. Однако при выравнивании нуклеотидных последовательностей данного изолята имелись замены, характерные для Mycobacterium smegmatis. Построение консенсусного ML-дерева, включающего все изоляты, изученные методом секвенирования, подтвердило принадлежность культуры к M. smegmatis. Изолят образовал один клад с M. smegmatis штамм. MC 2 155 и группой M. smegmatis JLS и KMS. Таким образом, учитывая широкое распространение M. smegmatis в природе (Wallace R.J et al., 1988; Brown B.A. et al, 1999), можно предположить сочетанную инфекцию двумя видами возбудителей с последующим выделением их ДНК, что и способствовало перекрёстной реакции с праймерами на район mig-гена, специфичный для M. avium.



      1. Генетическая характеристика изолята M. tuberculosis

При построении консенсусного ML-дерева изолят M. tuberculosis, полученный в 2000 г. от крупного рогатого скота образовал одну кладу с изолятом M. tuberculosis AM709731, выделенным на территории Кувейта в 2007 г., с индийским изолятом 2005 года DQ133991 и с китайским изолятом AJ307713, выделенным в 2001 г. Гомология данного изолята с последовательностями прототипных штаммов, выделенных на территории Европы и Азиатских стран, указывает на то, что ген не претерпел изменений. В то же время отмечена аминокислотная замена в паттерне RTG→RTE. В то же время глицин, заменивший глутаминовую кислоту имеет существенно меньший размер. Таким образом, эта замена является консервативной и, вероятно, не может повлиять на свойства белка в данном участке (Шульц Г., Ширмер Р., 1982). Однако с точки зрения изучения лекарственной устойчивости необходимо учесть одно немаловажное обстоятельство: у M. tuberculosis в отличие от некоторых бактериальных патогенов (S. typhimurium, S. aureus) в геноме имеется только по одной копии генов 16S и 23S РНК. Следовательно – одна мутация в соответствующем кодоне может привести к доминированию резистентности или резистентного фенотипа: все рибосомы будут устойчивы к таким ингибиторам белкового синтеза, как, например, стрептомицин или кларимицин.


2.3.6. Индикация и идентификация атипичных микобактерий у грызунов
Объектом исследований служили следующие виды грызунов: Apodemus agrarius, Apodemus uralensis, Clethryonomis gloreolus, Clethryonomis rutilus, Microtus arvalis, Microtus gregalis, Microtus oeconomus, Sorex araneus, Sorex caecutiens, отловленные на территории Новосибирской области. Для анализа был взят биоматериал из печени, селезёнки и лёгких грызунов.

После обработки 235 проб рост на питательных средах атипичных микобактерий зарегистрировали в 27 случаях (11,5%). При посеве на питательную среду биоматериала от грызунов появление колоний регистрировали в среднем на 5-е сутки. Рост типичных микобактерий не был установлен. После типирования полученных культур, основанного на образовании пигмента и скорости роста, 6 (22,2%) из них отнесли ко II группе по классификации Раньона, 8 (29,6%) – к III группе и 13 (48,1%) – к IV группе. Культуры считали быстрорастущими, если рост колоний появлялся до 7-го дня инкубации при 37оС. К медленнорастущим относили микобактерии, у которых рост появлялся через 7 и более дней после посева на питательную среду.

Методом ПЦР был исследован биоматериал, полученный от грызунов и верхний слой засеянной питательной среды. Как видно из данных, представленных в таблице 5 наиболее информативным оказалось ПЦР-исследование верхнего слоя засеянной питательной среды, наименее информативным - культуральное исследование. Неполное совпадение полученных результатов исследований могло быть вызвано рядом причин: малое содержание микобактерий в органах, не попавших в пробу (при культуральном исследовании) или различная специфичность используемых праймеров для постановки реакции. ПЦР-анализ полученных культур, ДНК, выделенной из биоматериала от мышей и верхнего слоя засеянной питательной среды показал наличие M. avium (n=6), M. fortuitum (n=3) и M. smegmatis (n=1). 4 культуры принадлежали к M. microti. Из 235 проанализированных проб в 5 (2,1%) пробах выявлено сочетанное инфицирование двумя видами микобактерий. При этом в 4 из них выявлено сочетание M. avium и M. microti, в 1 - M. avium и M. fortuitum. Инфицирование грызунов M. avium complex без каких-либо клинических и патологоанатомических признаков позволяет говорить о грызунах как о резервуаре возбудителя и указывает на сформировавшийся природный очаг. При этом возникает риск сенсибилизации организма здоровых животных.

Таблица 5 - Кумулятивные данные по проценту грызунов, инфицированных различными видами микобактерий



Вид грызунов

Общее число проб

Культуральное исследование, %

ПЦР-анализ биоматериала,

%


ПЦР-анализ верхнего слоя среды,%

1

2

3

4

5

Apodemus agrarius (полевая мышь)

23

17,4

30,4

34,8

Apodemus uralensis (малая лесная мышь)

17

52,9

61,4

82,4

Clethryonomis gloreolus (рыжая полевка)

34

0

17,6

20,6

1

2

3

4

5

Clethryonomis rutilus (красная полевка)

35

5,7

31,4

31,4

Microtus arvalis (полевка обыкновенная)

8

50

50

53,8

Microtus gregalis (узкочерепная полевка)

27

14,8

18,5

37

Microtus oeconomus (полевка-экономка)

31

3,2

19,4

45,1

Sorex araneus (обыкновенная бурозубка)

40

7,5

12,5

16,3

Sorex caecutiens (средняя бурозубка)

20

0

30

32,6


3. ВЫВОДЫ.

1. Разработанная тест-система на основе ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям mig-гена, обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что было подтверждено генотипированием выявленных изолятов M. avium. Реакция достоверно выявляет ДНК исследованных референтных штаммов и изолятов M. avium. ПЦР с праймерами на район mig-гена позволяет достоверно идентифицировать M. avium от других видов микобактерий.

2. Установлено, что в Новосибирской области 63,2% случаях этиологическим фактором неспецифического реагирования крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих являются M. avium.

3. При генетическом изучении изолятов M. avium, выделенных от разных видов животных, не выявлено гостальной специфичности и генетической вариабельности.

4. M. avium , адаптируясь к организму несвойственных хозяев, приобретают несколько другие фенотипические характеристики, в основном у них изменяются культуральные свойства. На плотных питательных средах они проявляют фенотипические признаки типичных микобактерий.

5. На территории России установлена циркуляция потенциально нового вида микобактерий – M. arupense, относящихся к M. terrae complex. Впервые в мире M. arupense выделены от свиней, имеющих характерные для микобактериоза изменения лимфатических узлов.

6. В Новосибирской области отмечено широкое персистирование различных видов микобактерий в организме следующих видов грызунов: Apodemus agrarius (полевая мышь), Apodemus uralensis (малая лесная мышь), Clethryonomis gloreolus (рыжая полевка), Clethryonomis rutilus (красная полевка), Microtus arvalis (полевка обыкновенная), Microtus gregalis (узкочерепная полевка), Microtus oeconomus (полевка-экономка), Sorex araneus (обыкновенная бурозубка), Sorex caecutiens (средняя бурозубка).
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации «Использование полимеразной цепной реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами для определения видовой принадлежности микобактерий» (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, прот. № 4, 2007).

2. Методические рекомендации «Применение ДНК-маркеров при генетическом картировании культур Mycoplasma species, Fusobacterium neccrophorum и Mycobacterium avium» (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, прот. № 1,2008 г).

3. Учитывая высокую чувствительность ПЦР с праймерами на район mig-гена M. avium, считаем возможным включение данного метода в схему дифференциально-диагностических исследований на туберкулёз крупного рогатого скота и постановки предварительного диагноза на туберкулёз сельскохозяйственных животных.

4. При проведении лабораторной дифференциальной диагностики неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота целесообразна постановка ПЦР на спейсерную последовательность 16S-23S рРНК из биоматериала от животных реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих.
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Перспективы использования геоинформационных технологий в организации контроля за распространением туберкулёза в Новосибирской области / Соавт.: В.Н. Афонюшкин, М.В. Качкин // Информационные технологии, информационные измерительные системы и приборы в исследовании с.-х. процессов: Матер. науч. практ. конф. – Новосибирск, 2003 – с. 340 – 342.

2. Применение базы данных по туберкулёзу в условиях Сибирского региона / Соавт.: М.В. Качкин, С.Г. Тупота // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных.: Тр. II Международной науч.-практ. конф. молодых учёных (20 – 21 апреля 2006 г., пос. Краснообск) / РАСХН Сиб. отд-ние. – Новосибирск, 2006, - с. 413 – 417.

3. Выделение микобактерий нетуберкулёзного комплекса у мелких млекопитающих и летучих мышей в благополучных по туберкулёзу районах / Соавт.: Н.А. Донченко, А.В. Зайковская, Ю.В. Кононова, Т.А. Дупал, Д.А. Васеньков, М.А. Потапов, А.М. Шестопалов // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Материалы III Российской науч. конф. с международным участием (27 – 29 сентября 2006) – Новосибирск, 2006 – с. 159 – 160.

4. Изучение участия рукокрылых (Mammalia, Chiroptera), обитающих в Западной Сибири, в циркуляции возбудителей зоонозов, потенциально опасных для человека/ Соавт.: А.В. Зайковская, Д.А. Васеньков, В.А. Терновой, А.М. Шестопалов, Н.А. Донченко, М.А. Потапов // Вестник КрасГУ, 2006. – №5. – с.98 – 102.

5. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения ДНК микобактерий туберкулёза/ Соавт Н.А. Донченко // Вестник КрасГУ, 2007. – №5. – с.129 – 132.

6. Молекулярная характеристика Mycobacterium tuberculosis, изолированного от крупного рогатого скота // Сибирский вестник с.-х. науки. – 2008. - № 4. - С. 117 – 119.






База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка