На правах рукописи Шапошник Елена Ивановна




Дата канвертавання26.04.2016
Памер336.48 Kb.



На правах рукописи

Шапошник Елена Ивановна


БИОлогические и биохимические особенности плодов растений рода ribes l. при интродукции
в белгородской области

03.00.05 – ботаника

03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Саратов - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования

«Белгородский государственный университет»

на кафедре биоценологии и экологической генетики



Научные руководители:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Сорокопудов Владимир Николаевич


кандидат химических наук, доцент

Дейнека Людмила Александровна




Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Коннова Светлана Анатольевна


доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Аладина Ольга Николаевна




Ведущая организация

ФГОУ ВПО Мичуринский государственный аграрный университет

Защита состоится « » 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83, E-mail: biosovet@sgu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского».

Автореферат разослан « » 2009 г.





Ученый секретарь

диссертационного совета С.А. Невский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность исследования. Род Смородина (Ribes L., 1734) принадлежит к семейству Grossulariaceae, включает 150 видов (Цвелев, 1981; Черепанов, 1981, 1995; Тахтаджян, 1987; Brennan, 1997) и является одним из наиболее широко распространенных в мире. Смородина черная и красная относятся к ягодным культурам, пользующимся заслуженным спросом, так как их плоды обладают диетическими и лечебно-профилактическими свойствами. Они содержат комплекс значимых биологически активных веществ (БАВ), таких как: витамины, микроэлементы, сахара и пектиновые вещества. Однако в настоящее время сортимент этих традиционных видов в Белгородской области требует обновления и расширения, также необходимо увеличение видового разнообразия. В последнее время смородины особенно привлекают внимание ученых в связи с высоким уровнем накопления в плодах антоцианов, значимость которых для лечения и профилактики заболеваний зрительного аппарата общепризнанна (Nakaishi, 2000; Watzl, 2002; Kong, 2003). Кроме того, в семенах смородины присутствует уникальное масло, содержащее α- и γ-линоленовые кислоты, имеющие важное значение для здоровья человека (Barre, 2001; Simoncíkova, 2002). Интродукция растений рода Ribes с использованием новых видов для создания культиваров с комплексом ценных хозяйственно-биологических признаков и адаптированных к местным условиям является актуальной в настоящее время (Огольцова, 1992; Сорокопудов, Мелькумова, 2003; Куминов, Жидехина, 2004; Аладина, 2007). Зависимость накопления БАВ растениями от условий выращивания делает актуальными исследования особенностей биологии и биохимии смородин в целом и новых культиваров рода Ribes в частности. Использование современных высокоэффективных аналитических технологий при исследовании комплекса БАВ позволяет выявить закономерности их биосинтеза и накопления, что старыми традиционными методами невозможно выполнить. При разнообразной переработке плодов необходимо учитывать содержание БАВ в получаемых продуктах и их сохранность при различных условиях хранения.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключается в выявлении биологических и биохимических особенностей растений рода Ribes L. при интродукции в Белгородской области.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- выявить фенологические особенности представителей рода Ribes в условиях Белгородской области;

- провести биоморфологический анализ сортообразцов Ribes nigrum L.;

- выявить анатомические особенности плодов и локализацию в них пигментов у представителей четырех подродов рода Ribes;

- исследовать химический состав плодов растений рода Ribes;

- изучить динамику накопления некоторых БАВ в плодах при созревании и хранении на примере отдельных сортов смородины черной;

- сопоставить ферментативную активность и определить особенности биосинтеза антоцианов и каротиноидов в плодах представителей подродов Eucoreosma Jancz., Ribesia (Berl.) Jancz., Symphocalyx Berl., Berisia (Spach) Jancz.;



- провести оценку использования антоцианов плодов Ribes nigrum L. в качестве пищевых красителей.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение биологических особенностей растений четырех подродов рода Ribes. Выявлены закономерности феноритмики представителей рода Ribes в условиях Белгородской области. На примере сортов разного эколого-географического и генетического происхождения Ribes nigrum установлено, что использование характеристики побегов, продуктивности и засухоустойчивости позволяет выявить наиболее адаптированные сортообразцы. На основании впервые проведенного сравнительного анатомического изучения плодов представителей четырех подродов рода Ribes установлены особенности их строения и выявлена локализация различных пигментов в разных частях клеток и тканей плодов. Установлены сроки максимального накопления антоцианов. Сравнительное изучение накопления БАВ (сахаров, аскорбиновой кислоты, антоцианов, каротиноидов, триглицеридов) в плодах различных смородин позволило выявить виды, перспективные для использования в пищевой и фармацевтической промышленности, доказать родство внутри подрода, рода и высокую степень родства с крыжовниками. Выявлены оптимальные условия для сохранности БАВ при длительном хранении плодов и продуктов их переработки.

Научно-практическая значимость. Полученные сведения являются основой при отборе перспективных для возделывания видов и культиваров смородин с комплексом хозяйственно-ценных признаков. Материалы по содержанию БАВ в растениях рода Ribes представляют практический интерес, так как позволяют выделить источники для получения высококачественных плодов с наибольшим накоплением БАВ. Результаты исследования изменчивости содержания БАВ в зависимости от условий произрастания и сроков сбора сырья следует учитывать при разработке мер по их рациональному использованию. Данные по методам переработки и условиям хранения могут использоваться в пищевой и фармацевтической промышленности для выбора оптимальных технологий переработки и хранения антоциан-содержащего сырья.

Результаты исследований включены в учебные курсы «Хроматографические и ионообменные методы» и «Спектральные методы анализа биологически активных веществ», используются при проведении лабораторных практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ при непосредственном участии автора.


Апробация работы. Основные положения и результаты работы представлены на: II Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2005); Международной молодежной научно-практической конференции (Белгород, 2006); III Международной научно-практической конференции "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности" (Санкт-Петербург, 2007); II научно-практической региональной конференции (Липецк, 2007); III и IV Международных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов (Владикавказ, 2006, 2008); 63-ей региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2008); V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар - Уфа, 2008); Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование, производство» (Воронеж, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, три из которых в изданиях Перечня ВАК РФ.



Декларация личного участия автора. Автор лично осуществил сбор объектов, провел полевые и лабораторные эксперименты, провел морфометрические, анатомические, спектрофотометрические и хроматографические исследования. Обработка полученных данных, их интерпретация, оформление проведены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора составил 30-80%. Исследования поддержаны грантом: «Скрининг видового разнообразия растений семейства Grossulariaceae Mill. Ботанического сада Белгородского государственного университета как методологическая основа создания адаптированного сортимента для условий Среднерусской возвышенности». Регистрационный номер: 2.2.3.1/349.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 185 страницах, включает 40 рисунков и 29 таблиц. Список литературы содержит 290 наименований, из которых 92 – на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфологические и фенологические параметры интродуцентов рода Ribes L. позволяют выделить перспективные виды и сорта для выращивания в условиях Белгородской области.

2. Качественный состав БАВ плодов (антоцианы, каротиноиды) изученных интродуцентов зависит от их видовой принадлежности; количественное содержание (антоцианы, сахара, аскорбиновая кислота) определяется видовой принадлежностью и стадией зрелости плодов.

3. Антоцианы смородины черной накапливаются в кожице плодов, сохраняются при сушке плодов в естественных условиях более 90% и являются перспективным источником для получения активной субстанции для медицинской и пищевой промышленности.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обосновываются актуальность исследования, его научная новизна, практическая значимость; сформулированы основная цель, задачи и пути их реализации, сведения об апробации работы и основные положения, выносимые на защиту.
Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ Особенности представителей рода Ribes L. (обзор литературы)
Приводится ботаническая характеристика представителей рода Ribes, материалы по биологии, хозяйственной ценности и интродукции видов и сортов по территории Евразии. Описаны изучаемые классы БАВ. Рассмотрены современные аспекты использования плодов растений рода Ribes для промышленной переработки.
Глава 2. Условия, материалы

и методы проведения исследований


Работа выполнена в Ботаническом саду природного парка «Нежеголь» Белгородского государственного университета. Климат умеренно-континентальный, в целом характеризуется недостаточным увлажнением. Почва опытного участка характеризуется как чернозем типичный слабовыщелоченный тяжелосуглинистый карбонатный. Продолжительность вегетационного периода колеблется от 163 до 187 дней, сумма температур выше 2°С составляет 2842-4209°С.

Объектами исследований являлись представители рода Ribes подродов Eucoreosma, Ribesia, Symphocalyx, Berisia: сорта с участием R. nigrum ssp. scandinavicum, R. dikuscha Fisch., R. nigrum ssp. europaeum Jancz., R. nigrum ssp. sibiricum Wolf.; R. aureum Pursh.; R. americanum Mill.; R. alpinum L.;


R. rubrum L.; R. warscewiczii Jancz. и сорта с участием R. petraeum Wulf.

Изучение феноритмики и морфологии видов проведено в соответствии с «Программой и методикой сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (Орел, 1999). Анатомическое изучение тканей плодов проводили по методике Н.М. Паушевой (1988). Засухоустойчивость сортов R. nigrum устанавливали с помощью прибора «Тургоромер -1» по методике М.Д. Кушниренко (1967). Содержание суммы сахаров и сухих растворимых веществ определяли рефрактометрическим методом.

Количественное и качественное определение других БАВ проводили в жидких экстрактах с использованием методов спектрофотометрии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Спектры в ультрафиолетовой и видимой области спектра записывали на приборе КФК-3-01 с использованием кварцевых кювет.

Хроматографические исследования проводили на хроматографических системах фирмы «Gilson» из комбинаций насосов «Altex 110A» или «Beckman 110B», крана дозатора «Rheodyne 7200» с петлей объемом 20 мкл, при спектрофотометрическом детектировании с использованием детекторов «Nicolet LC/9563» или «LCD 2563» (определение фенольных соединений, кислот, включая аскорбиновую) и рефрактометрическом детектировании R401 (Waters) (определение масел семян). Для регистрации и обработки хроматограмм использовали программное обеспечение «ЮНИХРОМ 97» (ООО «Новые аналитические системы»), «МультиХром 1,5» (Ampersand ltd). Исследования проводили с использованием хроматографических колонок: 250×4,0 мм Ultrasphere ODS (Beckman); 150×4,0 мм, Диасфер-110-С18; 5 мкм («БиоХимМак», Россия); 250×4,0 мм, Reprosil-Pur C18-AQ, 5 (Др. Майш); 250×4,0 мм Сепарон SGX С18; 250×4,0 мм, Кромасил С18. Расход элюента - от 0,6 до 1,0 мл/мин.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по методикам Б.А. Доспехова (1985) и Г.Н. Зайцева (1991) с определением среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала (Моисейченко, 1996). Для обработки результатов использовали программный продукт NIRSMAIN и MSExcel (Microsoft Office 2003).
Глава 3. ФЕНОлогические особенности видов рода Ribes L. при интродукции
Начало вегетации в условиях Белгородской области у растений, относящихся к подродам Eucoreosma и Berisia, наступает в III декаде марта–I декаде апреля. Растения подрода Ribesia, а также R. aureum, относящиеся к подроду Symphocalyx, позже начинают рост.

В 2005-2006 гг. у сортов R. nigrum, имеющих разное эколого-географическое происхождение, вегетация начиналась в I–II декадах апреля, при достижении суммы эффективных температур 48–191С, а в 2007-2008 гг. - на 10-15 дней раньше обычного наступления периода вегетации (Сорокопудов, 2009). У сортов, производных от R. nigrum ssp. scandinavicum и R. nigrum ssp. europaeum x R. nigrum ssp. sibiricum x R. dikuscha, вегетация начинается рано - в конце второй–начале третьей декады марта, когда сумма эффективных среднесуточных температур составляет 70-120С. Для R. americanum получены аналогичные результаты, вегетация в 2008 г. началась на 13 дней раньше при накоплении тепла 86-106С (рис. 1). Это изменение начала вегетации отражает реакцию растений на изменения условий среды, так как в период 2007-2008 гг. наблюдалась достаточно ранняя весна и высокая солнечная активность, температура днем в марте часто достигала +10 + 12С, а иногда доходила даже до + 15 + 17С. Самое позднее начало вегетации наблюдалось у R. aureum, относящейся к подроду Symphocalyx, однако наблюдается существенное вариирование в сроках начала вегетации, что отражает некоторые особенности физиологии, приобретенные на протяжении филогенетического развития. Вегетация у видов подрода Ribesia обычно начиналась в I–II декадах апреля при сумме эффективных среднесуточных температур 113-149С, однако в 2008 г. у всех видов этого подрода вегетация началась раньше на 10-16 дней и отмечена в последних числах марта, при этом сумма эффективных среднесуточных температур составила 146-157С.


Рис. 1. Основные фенофазы представителей рода Ribes в условиях Белгородской области:



____ - вегетация, ____ - цветение, ____ - созревание

Несмотря на разницу в наступлении сроков начала вегетации, сумма эффективных среднесуточных температур, необходимая для этой фенологической фазы, для отдельного вида сопоставима с предыдущими годами (кроме R. aureum).

В 2007 г. цветение растений подрода Ribesia происходило с III декады апреля до конца I декады мая (169-194С), а в 2008 г. у всех представителей подрода Ribesia цветение началось во II декаде, а завершалось в III декаде апреля (при сумме эффективных температур 170-192С). Сопоставление сроков созревания представителей подрода Ribesia выявило большие различия начала и окончания этой фазы за годы исследований. Если в 2007 г. созревание у большинства представителей начиналось в I декаде июля и оканчивалось во II декаде, то в условиях вегетационного периода 2008 г. началось во II декаде июня и завершилось уже в конце III декады, а у R. warscewiczii наблюдалось в I – II декадах июня. Наступление листопада отмечено во II – III декадах сентября. Цветение R. nigrum начинается через 3-4 недели после распускания почек с отклонениями до 7 дней, а у представителей подрода Ribesia значительно меньше, и они раньше всех начинают цветение, растения R. americanum зацветают на 5-11 дней позже, чем R. nigrum. От начала цветения до начала созревания ягод у R. nigrum проходит значительный период – 40-50 дней. Однако он короче, чем у остальных видов, поскольку именно растения R. nigrum наиболее адаптированы к условиям Белгородской области. Ягоды R. nigrum созревают за 5-12 дней (до полной спелости часто нужно 15-20 дней). Самые поздние сроки прохождения фазы созревания характерны для R. americanum. R. alpinum и R. aureum имеют сходные сроки наступления фазы созревания, но период созревания длиннее, чем у смородины черной.

На основании сравнения сроков прохождения фаз развития представителей подродов Eucoreosma, Ribesia, Symphocalyx, Berisia в условиях Белгородской области выявлено, что раньше остальных начинают вегетацию растения R. americanum, а цветение - представители подрода Ribesia, за которыми и R. nigrum. Самые поздние сроки прохождения фазы созревания характерны для R. americanum. Для всех фаз у изученных интродуцентов отмечены различные сроки их прохождения в разные годы, при этом сумма эффективных температур сопоставима по значению.


Глава 4. Биоморфологические и анатомические аспекты представителей Ribes L.
Важными критериями оценки интродуцентов при введении в культуру являются морфометрические показатели, способность к плодоношению и образованию полноценных семян (Некрасов, 1980). Из элементов продуктивности R. nigrum изучены: длина кисти, число цветков в кисти, число ягод в кисти, средняя и максимальная масса ягод, семенная продуктивность и их завязываемость, а также масса ягод на 1 м прироста.

В условиях Белгородской области среднее значение длины кисти варьирует по генетическим группам от 2,9 до 5,2 см. Размах изменчивости по числу цветков в кисти у трех генетических групп составил от 5,4 до 11,4 шт. Показатель числа ягод в кисти проявил сходные с предыдущим тенденции: среднее значение признака по всем генетическим группам от 4,0 до 7,6 штук.

Завязываемость ягод по генетическим группам варьировала от 45 до 84%, максимальное значение (более 80%) отмечено у сортов Орловия (в I генетической группе), у сорта Надина (во II) и у сортов Добрыня, Зуша, Лентяй (в III). Cредняя масса ягод по среднемноголетним данным составляет от 0,66 г у сорта Рясная до 1,60 г у сорта Экзотика. Максимальная масса ягод по сортам варьировала от 1,40 до 2,93 г. Наибольшее количество семян в ягодах отмечено у сорта Зеленая дымка, наименьшее у сорта 6-10-42. Масса 1000 семян варьировала от 0,8 г у сорта Чаровница до 1,73 г у сорта 6-21-103. Доля семян в ягоде изменялась от 2,1 у сорта Нара до 7,0% у сорта Зеленая Дымка. Одним из наиболее важных показателей продуктивности является масса ягод на 1 м прироста, который изменялся в генетических группах от 93,2 до 381,5 г/м. Максимальный показатель этого признака наблюдался у сорта Экзотика (относящегося к III генетической группе).

Климат Белгородской области характеризуется недостаточным увлажнением, поэтому оценка засухоустойчивости является важным этапом при интродукции. Коэффициент засухоустойчивости R. nigrum разного эколого-географического и генетического происхождения составил: у R. nigrum ssp. scandinavicum – 0,785; R. nigrum ssp. europaeum x R. nigrum ssp. sibiricum x R. dikuscha – 0,809.

Для плодов растений рода Ribes установлено, что накопление антоцианов осуществляется в кожице. Анатомическое изучение плодов подтвердило, что антоцианы содержатся в клеточном соке эпидермальных клеток и первого ряда субэпидермальных, что и обуславливает темную окраску плодов (рис. 2). При этом антоцианы в клетках расположены не изолировано, а равномерно распределены в цитоплазме.




Рис. 2. Клетки кожицы плодов
R. nigrum с окрашенной антоцианами цитоплазмой (продольный срез)

40/0,065 х 10/18



Рис. 3. Клетки мякоти плодов R.nigrum
с хромопластами

40/0,065 х 10/18


В плодах растений рода Ribes клетки мякоти содержат хромопласты шарообразной формы, содержащие желтый пигмент (каротиноиды) (рис. 3). Хромопласты присутствуют во всех клетках паренхимы и эпидермиса, но плохо обнаруживаются в эпидермальных клетках из-за окраски клеточного сока антоцианами.

Клетки эпидермиса R. aureum и паренхимы сходны с клетками у R. nigrum. Отличительной особенностью смородины золотистой является ярко-окрашенная оранжевая мякоть, что связано с наличием большого количества хромопластов, имеющих ярко-желтый цвет и содержащих каротиноиды, при этом хромопласты обнаружены как в клетках паренхимы, так и в эпидермальных клетках.

Кожица плодов представителей подродов Ribesia и Berisia менее плотная, чем у черноплодных особей, мякоть плодов белая у представителей подродов Ribesia и ярко-желтая у R. alpinum. При этом локализация пигментов как у других изученных видов. Одновременный биосинтез каротиноидов и антоцианов характерен для растений, однако чувствительность каротиноидов к кислой среде, необходимой для существования антоцианов, разделяет концентрирование этих пигментов по разным частям клетки.


Глава 5. Биохимический состав плодов растений
рода
Ribes L. при интродукции
Оценка содержания сухих растворимых веществ (СРВ) и суммы сахаров в плодах R. nigrum, выращенной в Белгородской области, выявила зависимость этого показателя от генетического происхождения: самые высокие значения отмечены во второй группе, самые низкие - в первой, а третья группа занимает промежуточное положение. В среднем по виду
R. nigrum содержание СРВ в плодах составляет 16,4%, а сумма сахаров – 10,1% (табл. 1). При этом в целом для вида характерна высокая изменчивость содержания СРВ - 13,6%, в то же время колебания общего содержания сахаров в плодах превышают 21%.

Таблица 1

Содержание биологически активных веществ в плодах различных видов смородин

Вид смородины

Содержание

Титруемая кислотность, %

СРВ, %

суммы сахаров, %

аскорбиновой кислоты, мг%

R. nigrum

16,4±2,5

10,1±3,6

183,2±44,5

2,23±0,42

R. americanum

17,7±2,1

16,5±1,9

61,0±4,8

1,63±0,18

R. aureum

19,8±3,4

14,4±2,5

39,1±5,3

1,09±0,20

R. alpinum L.

17,2±1,6

10,5±1,0

17,3±2,1

0,09±0,01

R. rubrum (сорт Голландская розовая)

14,1±0,3

8,6±0,2

21,8±2,9

1,92±0,22

R. warscewiczii (сорт Виксне)

14,5±0,9

8,9±0,6

33,3±3,2

2,14±0,26

R. rubrum x R. petraeum (сорт Нива)

15,2±1,3

9,3±1,8

41,2±3,0

1,50±0,20

В ягодах R. americanum содержится сухих веществ 17,7%, а сахаров - 16,5%. Плоды R. aureum содержат СРВ больше чем другие виды - 19,8%. Содержание СВР и сахаров в плодах R. alpinum выше значений, характерных для R. nigrum, и составляет 17,2 и 10,5%, соответственно. Представители подрода Ribesia отличаются значительно меньшим накоплением СВР и суммы сахаров, чем изученные особи других подродов (см. табл. 1).

Варьирование кислотности плодов рода Ribes связано с качественным составом органических кислот, особенностями вида или сорта и периодом вегетации (Осокiна, 2007). В зрелых плодах R. nigrum, независимо от сорта в условиях г. Белгорода, основными по содержанию органическими кислотами являются аскорбиновая, лимонная и яблочная (рис. 4).




Рис. 4. Хроматограмма разделения кислот экстракта R. nigrum L.:

1- яблочная кислота, 2 – не идентифицирован,
3 – аскорбиновая кислота, 4 – лимонная кислота
Содержание аскорбиновой кислоты (определено методом ВЭЖХ) в плодах различных сортов R. nigrum варьировало от 79 до 312 мг%, при этом накопление витамина С зависело и от стадии зрелости плодов. Для
R. americanum обнаружено значительно меньшее количество – 61 мг%, и еще ниже для R. aureum – 39 мг% (см. табл. 1). Представители подрода Ribesia концентрируют аскорбиновую кислоту в небольших количествах от 20 до 42 мг%, но еще более низкое содержание витамина С у R. alpinum - 17 мг%.

БАВ обладают таксономической специфичностью (Пасешниченко, 2001), что объясняется различной ферментативной составляющей процесса синтеза этих веществ в растениях (Jordheima, 2007). Антоцианы, конечные вещества в цепи метаболизма фенилпропаноидных соединений в растениях, обнаружены в виде производных шести основных антоцианидинов, которые могут быть сгруппированы в ряды: дельфинидиновый (дельфинидин, Dp; петунидин, Pt; мальвидин, Mv), пеларгонидиновый (пеларгонидин, Pg) и цианидиновый (цианидин, Cy; пеонидин; Pn). Различия биосинтеза антоцианидинов в растениях обусловлены активностью соответствующих ферментов: флавонолгидроксилаз и метилтрансфераз. В дальнейшем различия между антоцианами обусловлены типом гликозилирования, также зависящего от типа и активности ферментной системы.

Анализ качественного состава антоцианов показал, что генетически детерминированное подавление синтеза метилтрансфераз, приводящих к появлению в антоциановых комплексах производных пеонидина или мальвидина и петунидина (Дейнека, 2008), является важной биохимической характеристикой рода Ribes. В доступных нам видах смородин с красными плодами гидроксилирование кольца В заканчивается на дигидрокверцетине (предшественнике цианидина), а дигидромирицетин (предшественник дельфинидина) не синтезируется (Сорокопудов и др., 2005).

Вследствие обычной недоступности стандартных образцов требующихся антоцианов общепринято спектрофотометрическое определение (Giusti, 2001) их общего содержания в пересчете на цианидин-3-глюкозид, а мольное соотношение между индивидуальными антоцианами оценивали по соотношению площадей соответствующих пиков (табл. 2).

Таблица 2

Состав антоцианового комплекса плодов некоторых растений рода Ribes



Вид смородины

Доля антоцианов по площадям пиков, %

Сумма компонентов, %

Dp-3-Glu

Dp-3-Rut

Cy-3-Glu

Cy-3-Rut

ΣRut

ΣDp

R. aureum

9,0

4,2

40,3

42,4

46,6

13,2

R.. americanum

9,9

12,0

21,5

53,6

65,4

21,9

R. lacustre

12,0

18,0

16,6

50,5

68,5

30,0

R. nigrum ssp. sibiricum

15,8

24,9

9,9

35,1

60,0

40,7

R. nigrum (Грация)

9,1

45,0

3,3

37,9

82,9

54,1

G. reclinata

3,2

3,2

21,0

63,2

66,4

6,4

На хроматограммах экстрактов плодов всех исследованных сортов


R. nigrum, выращенных в Белгородской области, обнаружены четыре основных пика, идентифицируемые как 3-рутинозиды и 3-глюкозиды цианидина и дельфинидина (рис. 5), которые оказываются неизменным и вне зависимости от происхождения и региона выращивания. Содержание дельфинидиновых (ΣDp) компонентов выше, чем цианидиновых.




Рис. 5. Разделение антоцианов черноплодных смородин


AR. americanum Mill.; БR. lacustre (Pers.) Poir.; BR. nigrum ssp. sibiricum;
ГR. nigrum L. (сорт Белорусская Сладкая); ДR. aureum Pursh.:

1 – Dp-3-Glu; 2 – Dp-3-Rut; 3 – Cy-3-Glu; 4 – Cy-3-Rut

Основными антоцианами черноплодных представителей рода Ribes являются глюкозиды и рутинозиды дельфинидина и цианидина, хотя и в различном соотношении. Антоцианы R. aureum образованы почти исключительно цианидином (глюкозид и рутинозид), а доля дельфинидиновых компонент в ряде образцов сводится к минорным (см. рис. 5) (это также характерно для крыжовника). Такой состав антоцианов характеризует ферментативную систему смородины золотистой подавлением синтеза флавонол-3’,5’-гидроксилаз. По видовому составу пигментов R. americanum занимает промежуточное положение между плодами R. nigrum и R. aureum. Оценивая активность в плодах R. americanum флавонол-гидроксилаз (по сумме производных дельфинидина, ΣDp), следует отметить, что флавонол-3’,5’-гидроксидаза присутствует в значительно меньшем количестве, чем в плодах смородины черной.

В плодах красных смородин разнообразие антоцианов определяется активностью ферментов, отвечающих за перенос углеводных фрагментов, обеспечивающих разнообразие только за счет различного характера гликозилирования производных цианидина: в различных видах по-разному сочетается активность 6”-рамнозил и 2”-ксилозил или 2”-глюкозилтрансфераз. Результаты исследований плодов подрода Ribesia оказались аналогичными известным литературным данным (Newsome, 1989). Их антоциановый состав не похож на состав пигментов черноплодных растений рода Ribes: основные антоцианы представлены цианидин-3-2”-глюкозилрутинозидом и цианидин-3-2”-ксилозилрутинозидом, с преобладанием последнего. Для антоцианового комплекса R. alpinum, представителя подрода Berisia, характерен синтез по направлению дигидрокемпферол→дигидрокверцетин (обнаружены два основных компонента – цианидина-3-глюкозид и цианидин-3-рутинозид), что свидетельствует о наличии фермента флавонол-3’-гидроксидазы и пониженной активности (или недостатке) фермента флавонол-3’,5’-гидроскидазы. Обнаружено преобладание рутинозидов, что обусловлено активностью рамнозилтрансферазы.

Количественное содержание пигментов имеет важное значение как при выделении ценных перспективных образцов, так и при отборе для промышленного выращивания и переработки. Высокий уровень накопления антоцианов в плодах R. nigrum для всех исследованных сортов связан с высокой активностью ферментов, гидроксилирующих кольцо В флавонолов и рамнозилтрансфераз, синтезирующих рутинозиды. Впрочем, самая низкая активность флавонол-гидроксидаз сопряжена с наименьшим суммарным накоплением антоцианов.

Максимальный уровень накопления антоцианов в плодах R. nigrum исследованных сортов заметно выше, чем в сортах селекции британских (Slimestad, 2002; Kapasakalidis, 2006; Bordonaba, 2008) и латвийских (Kampuss, 2004) исследователей, но уступает показателям, достигнутым литовскими специалистами (Rubinskiene, 2006). Это является следствием климатических условий выращивания R. nigrum, поскольку в разные годы при различных погодных условиях выращивания этой культуры в Белгороде получены различные результаты 155–240 мг на 100 г свежих плодов (табл. 3). Но при этом различия в качественном составе антоцианов оказываются заметно меньше.

Таблица 3

Накопление антоцианов в плодах растений рода Ribes по годам (мг/100 г)


Название вида (гибрида)

2005

2006

2007

2008

Ribes nigrum

150,1±20,0

177,6±20,7

194,8±37,5

238,4±31,4

Ribes americanum

480,1±25,1

390,3±20,2

447,4±32,0

431,4±37,6

Ribes aureum

445,1±34,4

438,8±33,9

480,8±37,2

517,5±40,1

Ribes alpinum

14,6±1,6

15,3±3,0

16,3±2,0

26,9±5,0

R. warscewiczii (Виксне)

110,0±26,8

170,0±21,3

160,9±31,4

128,3±22,3

R. rubrum x R. petraeum (Нива)

32,0±3,1

45,7±4,4

54,5±6,3

55,2±7,3

R. rubrum (Голландская розовая)

5,0±1,6

4,5±0,8

6,1±1,4

6,0±1,2

При спектрофотометрическом определении общего содержания антоцианов установлено, что в плодах R. аmericanum и R. aureum накопление этих важнейших пигментов составляет 430-518 мг на 100 г ягод в пересчете на цианидина-3-глюкозид. Следовательно, ягоды R. americanum и R. aureum могут рассматриваться как важнейшие потенциальные источники для промышленного получения натуральных красителей.

Плоды представителей подрода Ribesia существенно менее богаты антоцианами: от 5 мг у сортов с розовой окраской плодов до 170 мг на 100 г свежих ягод, которые имеют насыщенный бордовой цвет. Низкое накопление пигментов позволяет судить о пониженной активности всей ферментативной системы, связанной с синтезом антоцианов.

В 2005 г. при исследовании плодов более 30 сортов R. nigrum в стадии технической зрелости получены низкие результаты – 65-160 мг/100 г, но при съеме ягод в более поздние сроки (спустя 1-3 недели), содержание антоцианов увеличивалось примерно в 1,5 раза, поэтому изучена динамика накопления пигментов. В 2007- 2008 гг. при изучении динамики накопления антоцианов установлено: синтез антоцианов в плодах начинается в середине-конце июня, визуально сопровождаясь переходом окраски плодов из зеленой в бурую и далее в черную. Для сортов всех генетических групп содержание антоцианов стабильно растет до середины-конца июля, а затем идет плавное снижение концентрации пигмента.

В растениях рода Ribes, в том числе и в плодах, синтезируются каротиноиды. Синтез каротиноидов у высших растений происходит в хромопластах (Takashi, 1991). Субстратом для образования каротиноидов служит ацетил-CoA, который в ряде биохимических реакций превращается в тетрапенфитоин (Harrison, 1988) и в результате образует фитофлуин;


ζ-каротин; нейроспорин и транс-ликопин (Гончарова, 1993). В анаэробных условиях из ликопина синтезируются циклические каротиноиды (Beyer, 1989). Десатурация и циклизация приводят к образованию α- и β-каротина (Chamovitz, 1992).

Содержание каротиноидов в плодах и их качественный состав зависят от вида растения. Каротиноидный комплекс R. aureum представлен в основном β-каротином (рис. 6), что свидетельствует о высокой активности ферментов, отвечающих за десатурацию и циклизацию, при этом общее содержание каротиноидов в пересчете на β-каротин у разных форм составило от 8,03 до 18,73 мг%. Основным компонентом каротиноидного комплекса


R. alpinum (см. рис. 6) является ликопин, и содержится лишь небольшое количество β-каротина, т.е. биосинтез каротиноидов завершается на более ранних стадиях. Общее содержание каротиноидов в смородине альпийской составляет 4,7-20,2 мг% (в пересчете на ликопин).

Рис. 6. Хроматограмма разделения каротиноидов плодов:


А - R. aureum Pursh.; Б - R. alpinum L.;

1 – дигидроксипроизводные; 2 – β-криптоксантин; 3 – ликопин; 4 – β-каротин
Концентрирование каротиноидов в плодах R. aureum и R. alpinum происходит в кожице, где их содержание в 4-7 раз превосходит общее. Плоды представителей подрода Eucoreosma содержат каротиноиды в очень малых количествах - 0,13-0,79 мг%, т.е. не превышают 1 мг%, а в плодах подрода Ribesia каротиноиды в детектируемых количествах не обнаружены.

Каротиноиды обнаружены и в составе семян смородин. Основным компонентом пигментов семян всех изученных видов рода Ribes является


β-каротин. Содержание пигментов составило для R. nigrum – 1,31 мг%,
R. aureum различных форм – 3,73-7,64 мг%, R. alpinum – 3,30-4,42 мг%, а для представителей подрода Ribesia – 0,52-2,05 мг%.

Масла семян растений рода Ribes являются уникальными и довольно близкими по составу: они относятся к высыхающим, т.е. содержат большое количество триеновых кислот (в триглицеридах по времени удерживания менее 19 мин). Судя по хроматограмме (рис. 7), масло семян растений рода Ribes (R. nigrum и R. alpinum), содержит триглицериды, образованные с участием радикалов двух различных октадекатриеновых кислот: α- и γ- линоленовых (11-16% от общей массы жирных кислот), - а так же тетраеновой – стеаридоновой кислоты.



Рис. 7. Разделение триглицеридов масла семян


А - R. nigrum, Б - R. alpinum, В - Grossularia reclinata

Информация о соотношении различных типов триглицеридов может быть использована для установления фальсификации масла семян смородины.


Глава 6. Практические аспекты использования плодов смородины черной для промышленной переработки
Исследуя изменение содержания аскорбиновой кислоты в плодах
R. nigrum при хранении при температуре -12С установили, что после двух месяцев хранения сохранность составила 91,5%, после четырех - 75,7%, а спустя семь месяцев концентрация аскорбиновой кислоты в плодах снизилось до 66,9%. Сохранность витамина С в пюре из плодов R. nigrum с сахаром (соотношение 1:1) при хранении при температуре +4С через два месяца составила 86% от исходного, через четыре месяца выявлено незначительное снижение концентрации аскорбиновой кислоты до 84%, а через семь месяцев содержание витамина С составило 62%.

Влияние высушивания плодов на сохранность антоцианов R. nigrum изучали при комнатной температуре, при этом рассматривалось влияние добавок. Сохранность антоцианов плодов возрастала при сушке с добавками сахарозы (95,4%) и лимонной кислоты (92,9%), в отличие от контрольного образца (90,5%). Сохранность антоцианов R. nigrum при высушивании плодов при 50 и 80С составляет 86,8 и 67,2% соответственно, а при 100С – только 18,7%. Это важно, так как после сушки плодов черники в естественных условиях содержание антоцианов в них не превышает 41% (Дейнека, 2006). Сохранность антоцианов в пюре из плодов с сахаром (соотношение 1:1) через 2 месяца составила 50,5%, а через четыре месяца не превышала 24,7%.

При хранении антоцианов из плодов R. nigrum в разбавленном экстракте в холодильнике при + 4С в течение четырех недель существенных изменений их количества не наблюдается, и сохранность пигментов после месяца хранения остается 99,3%. В условиях комнатной температуры вне доступа прямых лучей солнечного света после первых двух недель снижение концентрации антоцианов составило 6,6% и в конце месяца достигло 8,7%. После 13 недель концентрация антоцианов в разбавленном растворе в холодильнике оставалась на уровне 97,6% от исходной, т.е. потери составили 2,4%, а в растворе, хранящемся в комнатных условиях, снижение достигало 26,4%. Спустя десять месяцев сохранность антоцианов в холодильнике составила 74,2%, а в комнатных условиях – 37,1%.

Впервые исследована возможность использования экстракта плодов


R. nigrum для окраски популярных белгородских минеральных вод (“Майская хрустальная” и “Крещенский родник”) с целью замены синтетических пигментов. При этом получены хорошие результаты: несмотря на то, что антоцианы обладают особой устойчивостью в сильнокислых средах и не столь стабильны при средних рН (4 - 8), стабильность окраски вод оказалась достаточно высокой. При хранении при комнатной температуре, также включая доступ прямого солнечного света, окраска сохраняется на уровне 60-75% от первоначальной интенсивности по истечении 6 месяцев с момента приготовления.
Выводы
1. Интродуцированные виды рода Ribes L. в условиях Белгородской области относятся к фенологически ранним растениям. Ритмы их сезонного развития соответствуют длительности вегетационного периода Белогорья. Установлено, что отклонения в сроках начала и особенностях прохождения фенофаз зависят от абиотических факторов, особенно от среднесуточной температуры и количества осадков.

2. Биоморфологический анализ R. nigrum L. показал различный уровень адаптивности культиваров. Высокий коэффициент продуктивности отмечен у сортов сложного генетического происхождения. Коэффициент засухоустойчивости R. nigrum выявил различную адаптивность сортимента: наименьшие значения отмечены у R. nigrum ssp. scandinavicum, образцы сложного генетического происхождения более засухоустойчивы.

3. Анатомические исследования плодов растений рода Ribes L. позволили доказать содержание антоцианов только в клеточном соке эпидермальных и субэпидермальных клеток первого ряда кожицы плода. Каротиноиды накапливаются в хромопластах, имеющих шарообразную форму, во всех клетках паренхимы и эпидермиса, но маскируются в эпидермальных клетках антоцианами.

4. Плоды растений рода Ribes L. имеют сложный химический состав и содержат комплекс биологически активных веществ. Основными кислотами плодов смородин являются лимонная, яблочная и аскорбиновая. Наибольшие кислотность (2,23%) и содержание аскорбиновой кислоты (183,2 мг%) характерны для R. nigrum. Основными антоцианами черноплодных представителей рода Ribes L. являются 3-глюкозиды и 3-рутинозиды дельфинидина и цианидина, но в разном соотношении. Антоциановый состав представителей подрода Ribesia представлен цианидин-3-(2”-глюкозил)рутинозидом и цианидин-3-(2”-ксилозил)рутинозидом. Каротиноидный комплекс плодов R. aureum представлен в основном


β-каротином, а R. alpinum – ликопином. Масло семян смородин всех изученных видов содержит кроме линолевой, олеиновой, пальмитиновой и стериновой октадекатриеновые (α- и γ-линоленовые) и стеаридоновую кислоты.

5. Динамика накопления антоцианов при созревании плодов растений рода Ribes L. характеризуется вначале ростом концентрации до стадии полной зрелости с последующим плавным снижением без изменения качественного состава. Накопление аскорбиновой кислоты характеризуется плавным уменьшением по мере созревания.

6. Качественный состав антоцианов плодов растений рода Ribes L. определяется генетическим происхождением, активностью ферментов цикла биосинтеза антоцианов. Ферментный комплекс растений рода Ribes L. отличается низкой активностью метилтрансфераз и различной активностью флавонол-3’-гидроксилаз и флавонол-3’,5’-гидроксилаз, а также наличием 2”-глюкозил- и 2”-ксилозилтрансфераз. Каротиноидный состав плодов смородины альпийской определяется высокой активностью десатураз, обеспечивающих биосинтез в основном ликопина; в плодах смородины золотистой биосинтез каротиноидов заканчивается на более поздней стадии (на стадии β–каротина), благодаря включению в метаболизм циклаз.

7. Антоцианы черной смородины имеют высокую сохранность при сушке плодов и экстрактов в естественных условиях и хранении при +4С. Содержание антоцианов плодов R. nigrum в водном растворе в течение полугода при комнатных условиях остается 60-75%, что позволяет использовать их в качестве колорантов для прохладительных напитков.


СПИСОК основных РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* - публикации в печатных изданиях Перечня ВАК РФ




  1. * Дейнека Л.А., Сорокопудов В.Н., Дейнека В.И., Сиротин А.А., Шапошник Е.И., Головков А.В. Антоцианы плодов растений: Опыт экстракции и сушки // Теоретический журнал. Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. – 2006. - №4. – С. 28-31.

  2. * Сорокопудов В.Н., Бурменко Ю.В., Резанова Т.А., Маслова Н.Н., Пацукова Н.Г., Языкова В.В., Мартынова Н.А., Шапошник Е.И. Эколого-биологические аспекты адаптации некоторых интродуцентов сем. Grossulariaceae Dumort. в Белогорье // Проблемы региональной экологии. – 2009. - №1. – С. 111-117.

  3. * Дейнека Л.А., Шапошник Е.И., Гостищев Д.А., Дейнека В.И., Сорокопудов В.Н. Селеменев В.Ф. Антоцианы плодов некоторых сортов черной смородины // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2009. -Т. 9. - Вып.4. – С. 529-536.

  4. Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Шапошник Е.И., Сорокопудов В.Н., Сиротин А.А. Антоцианы черной смородины: экстракция и сушка // Изв. вузов. Химия и химическая технология. - 2006. – Т. 49. - №11. – С. 77-80.

  5. Сорокопудов В.Н., Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Шапошник Е.И. Сопоставление антоцианового состава плодов различных видов смородин // Материалы Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и в химической технологии растительного сырья» 21-22 апреля. – Барнаул. – 2005. - Т.1 – С.300-302.

  6. Кулясова М.А., Шапошник Е.И., Бурменко Ю.В. Перспективность использования смородины американской в условиях Центрального Черноземья // Материалы Международной молодежной научно-практической конференции, 14 апреля 2006 г. – Белгород: ИПЦ «ПОЛИТЕРРА». - 2006. – С. 271-273.

  7. Сорокопудов В.Н., Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Шапошник Е.И. Интродукция американской смородины в Белгородской области // Материалы международной научно-практической конференции: Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования. VII Международный симпозиум: Т.2. - Белгород: «Политерра». - 2006. – С. 209-212.

  8. Грошенко С.А, Шапошник Е.И., Бурменко Ю.В. Особенности фитохимии смородины американской и других видов в условиях Черноземья. // Материалы международной научно-практической конференции: Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования. VII Международный симпозиум: Т.2. - Белгород: «Политерра». - 2006. – С. 300-303.

  9. Шапошник Е.И., Головков А.В., Дейнека Л.А., Сорокопудов В.Н. Исследование накопления антоцианов в плодах черной смородины по мере созревания // Материалы международной научно-практической конференции: Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования. VII Международный симпозиум: Т.2. - Белгород: «Политерра». - 2006. – С. 360-363.

  10. Шапошник Е.И., Головков А.В. Пищевые колоранты из антоцианов черной смородины // Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки. Материалы III Международной дистанционной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов. – Владикавказ. - 2006. – С. 135-137.

  11. Головков А.В., Шапошник Е.И. Перспективные сорта черной смородины для Белгородской области // Антропогенное влияние на флору и растительность. Материалы II научно-практической региональной конференции. – Липецк. – 2007. – С. 157-159.

  12. Шапошник Е.И., Дейнека Л.А., Сорокопудов В.Н. Динамика накопления антоцианов в плодах смородины черной // «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Выпуск 63. Сборник научных трудов 63-ей региональной конференция по фармации и фармакологии. – Пятигорск, 22-26 января, 2008. – С. 123.

  13. Дейнека Л.А., Тикунова И.В., Шапошник Е.И., Мясникова П.А., Третьяков М.Ю., Дейнека В.И. Определение содержания антиоксидантов (антоцианов, каротиноидов, витамина С) в плодах некоторых видов смородин // «Нетрадиционное растениеводство. Селекция. Охрана природы. Эниология. Экология и здоровье». Материалы ХVII Международного симпозиума. – Алушта, 13-21 сентября, 2008. – С. 62-64.

  14. Дейнека Л.А., Саенко И.И., Шапошник Е.И., Сырцева О.П., Дейнека В.И. Использование природных антоцианов для подкрашивания минеральных вод // Международная научно-техническая конференция «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование, производство. – Воронеж, 1-4 октября, 2008. – С. 179.

  15. Сорокопудов В.Н., Головков А.В., Шапошник Е.И. Черная смородина в Белогорье – продуктивность и её слагаемые // Современные проблемы и перспективы отечественного садоводства: мат-лы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения профессора Е.С. Черненко / под общ. ред. проф. В.Н. Яценко. – Мичуринск: МГПИ, 2008. – С.240-244.



База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка