Исследование травы гречихи посевной (fagopyrum sagittatum gilib.)




Дата канвертавання19.04.2016
Памер342 Kb.


На правах рукописи
Анисимова Мария Михайловна


ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАВЫ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ (FAGOPYRUM SAGITTATUM GILIB.)

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Самара – 2011


Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образова­тельном учреждении высшего профессионального образования «Самарский госу­дарственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социаль­ного развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России)
Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор Куркин Владимир Александрович
Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Аввакумова Надежда Петровна

доктор фармацевтических наук,

профессор Пупыкина Кира Александровна


Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессио­нального образования «Курский государственный медицинский университет» Ми­нистерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации


Защита состоится «___» октября 2011 г. в ___ часов на заседании диссертацион­ного совета Д 208.085.06 при ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СамГМУ Мин­здравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).
Автореферат разослан «____»____________ 2011 г.
Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.К. Петрухина



ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время на фармацевтическом рынке РФ име­ется целый ряд лекарственных средств, обладающих ангиопротекторной активно­стью (Киселева Т.Л. и др., 2003). Большинство растительных лекарственных препа­ратов, рекомендованных для лечения заболеваний, сопровождающихся повышением проницаемости сосудов, продолжают поступать из-за рубежа (Германия, Польша, Украина и другие страны).

В медицине успешно применяются лекарственные растения, содержащие фла­воноиды. Ярким представителем из них является рутин, обладающий не только ан­гиопротекторной, капилляроукрепляющей активностью, но и антиоксидантным дей­ствием (Самылина И.А., Северцев В.А. и др., 2003). Так, рутин является универ­сальным органопротектором и применяется в качестве лекарственного средства, причем чаще всего в сочетании с аскорбиновой кислотой («Аскорутин», «Профи­лактин С», поливитаминные препараты).

На сегодняшний день основным источником получения рутина в фармацевти­ческой промышленности являются бутоны софоры японской, однако промышленная сырьевая база указанного растения в РФ отсутствует. Потребность в данном препа­рате удовлетворяется за счёт импорта (Бразилия, Германия, Китай), что не выгодно с экономической точки зрения. На наш взгляд, перспективным отечественным ис­точником рутина и других флавоноидов может являться трава гречихи посевной (Fagopyrum sagittatum Gilib.), широко культивируемая как ценная пищевая культура в РФ, в том числе и в Самарской области.

В цветущих побегах гречихи в качестве основного компонента содержится до 3-5 % рутина, а также сопутствующие ему другие флавоноиды, в частности, кверце­тин и изокверцитрин, однако данное сырье не используется как источник лекарст­венных препаратов.

Создание новых отечественных лекарственных средств на основе рутина за­труднительно по причине отсутствия унифицированного подхода к стандартизации субстанции и препаратов данного вещества и отсутствия отечественного государст­венного стандартного образца (ГСО) рутина.

Таким образом, представляется актуальным фитохимическое исследование травы гречихи посевной в рамках разработки отечественного стандартного образца и современных подходов к химическому анализу ЛРС, а также создание новых фла­воноидных отечественных средств на основе комплексного использования данного растения.



Цели и задачи исследования. Фармакогностическое исследование по обосно­ванию целесообразности использования травы гречихи посевной как потенциаль­ного сырьевого источника флавоноидных отечественных лекарственных препара­тов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:



  1. Исследование анатомо-морфологических признаков травы гречихи посевной.

  2. Изучение химического состава травы гречихи посевной.

  3. Разработка методик качественного анализа травы гречихи посевной.

  4. Разработка методик количественного определения рутина и суммы флавонои­дов в траве гречихи посевной.

  5. Изучение динамики накопления рутина и суммы флавоноидов в траве гречихи посевной.

  6. Разработка метода получения рутина из травы гречихи посевной и очистки дан­ной субстанции.

  7. Разработка методик анализа на субстанцию «Рутин».

  8. Изучение показателей качества рутина как стандартного образца.

  9. Обоснование возможности использования ГСО рутина в методиках качествен­ного и количественного анализа сырья и препаратов, содержащих рутин.

  10. Изучение показателей качества нового вида лекарственного растительного сы­рья «Гречихи посевной трава» и лекарственных препаратов на основе дан­ного растения «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

  11. Разработка проектов ФС «Гречихи посевной трава», ФСП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

  12. Обоснование целесообразности создания флавоноидных лекарственных препа­ратов на основе травы гречихи посевной.

Научная новизна. В результате изучения химического состава водно-спирто­вых извлечений травы гречихи посевной, культивируемой в Среднем Поволжье, в том числе и в Самарской области, впервые выделены и идентифицированы 5 инди­видуальных соединений – рутин (доминирующий компонент исследуемого расте­ния), а также кверцетин, изокверцитрин, хлорогеновая, кофейная кислоты. Установ­ление структуры и изучение физико-химических свойств выделенных веществ про­водилось с использованием УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии в сочетании с различными химическими превращениями (кислотный и ферментативный гидролиз). Впервые изучен флавоноидный состав травы гречихи посевной с использованием обра­щенно-фазовой ВЭЖХ.

Обоснована необходимость использования ГСО рутина в методиках качест­венного и количественного анализа травы гречихи посевной и препаратов на основе рутина.

Изучена динамика накопления флавоноидов, в том числе рутина, в траве гре­чихи посевной на протяжении всего периода вегетации. Установлено, что наиболее оптимальным временем сбора сырья данного растения является период массового цветения – начала плодоношения (содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин варьирует от 4,90 до 6,10 % в зависимости от места культивирования и года сбора).

С использованием цифровой микроскопии впервые проведены анатомо-гисто­логические исследования травы гречихи посевной, при этом выявлены диагностиче­ские признаки сырья, заключающиеся в наличии сосочковидных выростов по краю и по жилкам листа, аналогичных выростов на поверхности околоцветника, уголко­вая колленхима в ребрах стебля, особенностях строения гинецея, пыльцевых зерен.

Изучены показатели качества травы гречихи посевной и новых лекарственных препаратов «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой», которые нашли свое отражение в соответствующих проектах ФСП.

Обоснована целесообразность использования в медицинской практике нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава». Установлено, что жидкий экстракт гречихи обладает выраженным гепатопротекторным и ноо­тропным действием.

Обоснован способ получения рутина из травы гречихи посевной.

Практическая значимость. Разработаны методики качественного и количест­венного анализа травы гречихи посевной. Проверка на подлинность данного сырья основывается на определении рутина методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методики количественного анализа ЛРС гречихи посевной базируются на определении содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом спек­трофотометрии и рутина методом хроматоспектрофотометрии и ВЭЖХ.

Изучена динамика накопления флавоноидов в траве гречихи посевной. При этом отмечено в отходах травы гречихи посевной после обмолота высокое содер­жание действующих веществ (2,5 ± 0,10%), что служит доказательством возможно­сти безотходного использования данного растения.

Унифицированы методики качественного и количественного анализа сырья гречихи посевной и ЛС на основе рутина с использованием ТСХ-анализа, спектро­фотометрии и ВЭЖХ. С использованием методик анализа обоснованы способы по­лучения рутина и новых лекарственных препаратов из сырья гречихи посевной.

Разработаны показатели качества ЛРС «Гречихи посевной трава», ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

Разработаны новые унифицированные методики качественного и количествен­ного анализа сырья «Гречихи посевной трава», «Гречихи экстракт жидкий», «Гре­чихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина.

В проект ФС «Гречихи посевной трава» включены разделы «Внешние при­знаки», «Микроскопия», в которых нашли отражение иллюстрации микропрепара­тов сырья гречихи, изготовленных в процессе микроскопического исследования.

Оформлены проекты ФС «Гречихи посевной трава», ФСП на лекарственные препараты «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой», направленные на экспертизу в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского назначе­ния» Минздравсоцразвития РФ (входящий № 07а – ЦФМС от 19.01.11).

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре фарма­когнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедре химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, в ГУЗ «Центр кон­троля качества лекарственных средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы» (акты внедрения от 22.04.2011 г.).



Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Результаты анатомо-морфологического исследования травы гречихи посевной.

  2. Результаты изучения химического состава травы гречихи посевной.

  3. Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации ЛРС гре­чихи посевной и ЛП на основе рутина.

  4. Методики качественного анализа ЛРС «Гречихи посевной трава» и ЛП «Гре­чихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО ру­тина, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

  5. Методики количественного определения рутина и суммы флавоноидов ЛРС «Гре­чихи посевной трава» и ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экс­тракт густой» с использованием ГСО рутина, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

  6. Результаты исследований по обоснованию показателей качества травы гречихи посевной, а также лекарственных препаратов «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

  7. Способ получения рутина из травы гречихи посевной.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная ра­бота выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего про­фессионального образования «Самарский государственный медицинский универси­тет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ:

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профи­лактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопро­текторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препа­ратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на конферен­ции дипломированных специалистов «Молодые ученые - медицине» «Аспирантские чтения–2009»; на конкурсе программы «Участник Молодежного Научно-Инноваци­онного Конкурса» («УМНИК» 2009 г.); на VII Международном симпозиуме по фе­нольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (2009 г.); на X, XIII, XV Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2006, 2008, 2009 гг.); на инновационной смене Всероссийского Форума «Селигер-2010» по программе «У.М.Н.И.К. на СТАРТ» (2010 г.); II Российском фитотерапевтиче­ском съезде (г. Москва, 2010 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 25 научных работах, из них 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 158 страни­цах машинописного текста, содержит 19 таблицы, 66 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 156 источников, из которых 38 – на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи ис­следования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.



Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литера­туры по современному состоянию исследований гречихи посевной, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава расте­ния, фармакологической активности, применению в медицинской практике.

В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. При­ведены методики анатомо-морфологического, химического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также контроля качества ЛП на основе сырья гречихи посевной.

В главах 3-6 экспериментальной части приводятся результаты собственных ис­следований по изучению химического состава травы гречихи посевной, совершен­ствованию методик стандартизации данного сырья и ЛП на его основе, разработке новых препаратов, оценке их качества и обоснованию целесообразности внедрения в медицинскую практику в качестве ангиопротекторных ЛС.

В Приложения включены: результаты микроскопического анализа, материалы по разработке НД, акты внедрения.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статисти­чески и представлены в таблицах, формулах, на рисунках, которые приведены в тек­сте диссертации.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


  1. Морфолого-анатомический анализ травы гречихи посевной

Исследования морфолого-анатомического строения изучаемого сырья гречихи (лист, стебель, цветок, плод) и его порошка проводили с использованием цифрового микроскопа Motic DM111 (с кратностью увеличения 4х10; 10х10; 40х10; 100х10) и цифрового стереоскопического микроскопа Motic DM-39С-N9GO-A (возможность увеличения: х 20; х 40). Приготовление микропрепаратов проводили в соответствии с ГФ СССР XI издания.



Рис. 1. Результаты анатомо-гистологических исследований

Обозначения: А – Край листа с сосочковидними выростами; Б – Гинецей цветка; В – Уголковая колленхима стебля; Г – Пыльники; Д – эпидермис стебля; Е – поверхность околоцветника; Ж – Порошок травы с диагностическими признаками; З – Железка на эпидермисе стебля.

Микроскопический анализ травы гречихи позволил выявить диагностические признаки сырья, заключающиеся в наличии сосочковидных выростов по краю и по жилкам листа (рис. 1А), аналогичных выростов на поверхности околоцветника (рис. 1Е), уголковая колленхима в ребрах стебля (рис. 1В), особенностях строения гине­цея (рис. 1Б), пыльников и пыльцевых зерен (рис. 1Г). Результаты проведенного ис­следования подтверждаются соответствующими микрофотографиями (рис.1).


2. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья гречихи посевной. В результате изучения химического состава травы гречихи по­севной (Fagopyrum sagittatum Gilib.), культивируемой в Самарской области, выде­лены и идентифицированы 5 индивидуальных соединений, относящихся к флаво­ноидам (рутин, кверцетин, изокверцитрин) и фенилпропаноидам (хлорогеновая, ко­фейная кислоты) (табл. 1).

Для установления структуры выделенных веществ использованы данные ТСХ-анализа, УФ-, 1Н-ЯМР-спектров, результаты химических превращений, а также не­посредственное сравнение с достоверными образцами веществ. Отсутствие приме­сей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких систе­мах растворителей и с использованием различных способов детекции.

Таблица 1

Физико-химические характеристики

выделенных и идентифицированных соединений

№ п/п

Название, состав

Химическая формула

Физико-химические характеристики



Рутин:

C27H30O16






λmax (EtOH) 258, 267 (пл.), 362 нм

т. пл. 189-191ºС





Кверцетин:

С15Н10О7






λmax (EtOH) 257, 268 (пл), 372 нм.

Т.пл. 312-314 0С





Изокверцитрин:

С21Н20О10






λmax (EtOH) 257, 269 (пл.), 361 нм

т. пл. 223-225 ºС






Хлорогеновая кислота:

С16Н18О9






λmax (EtOH) 243, 300 (пл), 330 нм

Т. пл. 203-205О (вода).





Кофейная кислота:

С9Н8О4






λmax (EtOH) 243, 299 (пл), 328 нм

Т. пл. 182-184О (вода).



Рутин (1) желтое с зеленоватым оттенком кристаллическое вещество состава C27H30O16; УФ-спектр: λmax 257, 267пл, 362 нм. 1Н-ЯМР-спектр (200 МГц), δ, м.д.: 7,66 (д, 9 Гц, Н-21), 7,58 (д, 9 Гц, Н-61), 6,91 (д, 9 Гц, Н-51), 6,44 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,21 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,07 (д, 7 Гц, Н-111-глюкозы), 4,56 (д, 2 Гц, Н-1111-рамнозы), 4,4 – 3,2 (м, 6Н-глюкозы + 4Н рамнозы) (рис. 2).



Рис. 2. 1Н-ЯМР-спектр рутина в смеси дейтероацетона и D2O


  1. Исследование по стандартизации травы гречихи посевной

3.1. Качественный анализ сырья гречихи посевной

Для определения подлинности травы гречихи посевной разработана методика тонкослойной хроматографии (ТСХ).



3.1.1. Тонкослойная хроматография

В задачу исследования входил подбор системы растворителей и способа детектирования зон адсорбции на хроматограмме, позволяющих идентифицировать флавоноиды. Разделение флавоноидов было оптимальным в системе растворителей: хлороформ - метанол - вода (26:14:3) («Silufol UV 254») или н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2) («Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ», «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ»). В данных условиях четко разделяются флавоноидные и фенилпропаноидные соединения. Для обнаружения веществ на хроматограмме использовали детекцию в УФ-свете (254 нм и 366 нм).





Рис. 3. Схема ТСХ водно-спиртовых извлечений из травы гречихи посевной

Обозначения: 1 – водно-спиртовое извлечение из травы гречихи посевной (70% спирт этиловый); 2 – рутин; 3 – никотифлорин; 4 – изокверцитрин; 5 – кверцетин.

На хроматограмме обнаруживается доминирующее пятно с величиной Rf около 0,4 (рутин), а также проявляются другие пятна, в частности, пятно фиолетового цвета с величиной Rf - 0,2 (хлорогеновая кислота), с Rf - 0,45 (никотифлорин), Rf - 0,8 (кверцетин) и с Rf - 0,6 (изокверцитрин) (рис. 3), идентифицируемые с помощью достоверно известных образцов указанных веществ.

При проявлении хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокистоты (ДСК) также обнаруживается доминирующее пятно с величиной Rf~0,4 (на уровне аналогичного пятна ГСО рутина). Наличие доминирующего пятна рутина является аналитическим эффектом метода, позволяющим применять его в разделе «Качественные реакции».

3.1.2. Спектрофотометрия

Электронные спектры флавоноидных соединений и суммарных извлечений из ЛРС, содержащих флавонолы, характеризуются, как правило, 2 максимумами по­глощения. УФ-спектр раствора Б (рис. 4) должен иметь максимум поглощения при длине волны  max = 256 2 нм и 362 нм 2 нм (флавоноиды).

Следовательно, характер кривой поглощения раствора водно-спиртовых извле­чений из травы гречихи посевной практически соответствуют таковому электрон­ного спектра раствора рутина.

3.2. Количественный анализ сырья гречихи посевной

3.2.1. Количественное определение суммы флавоноидов в траве гречихи посевной

С учетом того, что трава гречихи посевной является перспективным источни­ком не только рутина, но и суммарных препаратов, нами предлагается анализиро­вать сумму флавоноидов, содержащихся в сырье изучаемого растения.

Для оценки количественного содержания суммы флавоноидов, содержащихся в траве гречихи посевной, был предложен метод дифференциальной спектрофотомет­рии с комплексообразователем AlCl3, при этом обоснована целесообразность ис­пользования ГСО рутина (рис. 4).



Рис. 4. Электронные спектры водно-спиртовых извлечений

травы гречихи посевной

Обозначения: 1 – водно-спиртовое извлечение из травы гречихи посевной; 2 – водно-спиртовое извлечение из травы гречихи посевной с добавлением AlCl3; 3 – дифференциальный спектр.

Расчет содержания суммы флавоноидов в гречихе посевной проводится при длине волны λ = 362 нм. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:



, где

D – оптическая плотность испытуемого раствора; Do – оптическая плотность раствора ГСО рутина; m – масса сырья, г; mо – масса ГСО рутина, г; W – потеря в массе при высушивании в процентах.

Содержание суммы флавоноидов в гречихе посевной варьирует от 5,30 до 6,10 % в зависимости от места культивирования и года сбора.

Таблица 2

Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в траве гречихи посевной


f



S

P, %

t (P,f)

X

E, %

10

5,41

0,10067

95

2,23

0,225

± 4,15

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве гречихи методом дифференциаль­ной спектрофотометрии представлены в таблице 2. Результаты статистической об­работки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного опре­деления рутина в траве гречихи посевной с доверительной вероятностью 95% со­ставляет ± 4,15%.

Для количественного изучения динамики накопления флавоноидов определяли спектрофотометрическую зависимость концентрации флавоноидов в сырье от фазы вегетации гречихи посевной.

Таблица 3

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин

в зависимости от фазы вегетации

Время сбора

образца

Фаза вегетации

Содержание флавоноидов, %

21 июня

1

начало вегетации

4,86 + 0,02

28 июня

2

Вегетация

5,01 + 0,03

06 июля

3

начало цветения

5,10 + 0,02

18 июля

4

Цветение

5,19 + 0,03

29 июля

5

Цветение

5,27 + 0,04

09 августа

6

массовое цветение

5,41 + 0,03

17 августа

7

массовое цветение – начало плодоношения

5,67 + 0,04

28 августа

8

начало плодоношения

5,59 + 0,04

12 сентября

9

трава после обмолота

2,51 + 0,04

Проведенные исследования образцов, собранных в разные фазы вегетации, свидетельствуют о том, что по мере роста гречихи концентрация БАС в вегетатив­ной массе вначале возрастает, достигая максимума во время полного (массового) цветения – начала плодоношения (в возрасте 30-40 дней), а далее постепенно уменьшается во время завязывания плодов (табл. 3).

Наибольшее содержание флавоноидов выявлено в образцах, собранных в фазу массового цветения – начала плодоношения, при этом трава гречихи после обмолота представляет собой не менее интересное сырье в качестве источника флавоноидов (2,51 + 0,04%).



3.2.2. Количественное определение рутина в траве гречихи посевной

В связи с тем, что спектрофотометрическая методика не позволяет избира­тельно определить целевое вещество (рутин) в смеси флавоноидных соединений, изучена возможность определения данного флавоноида методом хроматоспектрофо­тометрии.

Для оценки количественного содержания рутина в траве гречихи посевной был предложен метод хроматоспектрофотометрии с использованием ГСО рутина.

Хроматографическое разделение водно-спиртового извлечения из травы гре­чихи посевной проводили в системе растворителей: хлороформ - метанол - вода (26:14:3) на пластинках «Силуфол УФ 254» или «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ». Пятно соответствующее ГСО рутину со значением Rf около 0,4 вырезали и десорбировали в этиловый спирт.

Оптическую плотность полученных элюатов измеряли на спектрофотометре «Specord 40» в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 362 нм на фоне элюата контрольного опыта.

Содержание рутина в траве гречихи посевной в процентах (X) на абсолютно су­хое сырье вычисляли по формуле:



, где

D – оптическая плотность испытуемого раствора; Do – оптическая плотность раствора ГСО рутина; m – масса сырья, г; mо – масса ГСО рутина, г; W – потеря в массе при высушивании в процентах.

Содержание рутина в траве гречихе посевной, культивируемой в Самарской об­ласти, находится в диапазоне 2,50-3,70 %.

Метрологические характеристики методики количественного определения ру­тина в траве гречихи методом хроматоспектрофотометрии представлены в
таблице04. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения рутина в траве гречихи посевной с дове­рительной вероятностью 95% составляет ± 4,90 %.

Таблица 4



Метрологические характеристики хроматоспектрофотометрической методики количественного определения рутина в траве гречихи посевной

f



S

P, %

t (P,f)

X

E, %

10

3,05

0,06702

95

2,23

0,149

± 4,90


3.3. Исследование возможности использования метода ВЭЖХ для

стандартизации сырья гречихи посевной

В целях совершенствования стандартизации ЛРС гречихи посевной проведены исследования по изучению возможности использования метода ВЭЖХ, который одновременно может сочетать качественное и количественное определение флаво­ноидов.

Анализ водно-спиртовых извлечений из травы гречихи посевной проводили ме­тодом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Милихром-5» в изократи­ческом режиме (колонка КАХ 6-80-4 № 6 25.01.99, стационарная фаза – «Separon C18», подвижная фаза - смесь ацетонитрила и воды в соотношении 30:70 с добавле­нием 1% ледяной уксусной кислоты, скорость потока – 0,1 мл/мин). Детекцию флавоноидов проводили при аналитической длине волны λmax 360 нм, а также при других длинах волн: 254, 270, 290, 330 нм.

На хроматограмме испытуемого раствора (рис. 5А) пик № 3 соответствует по времени удерживания пику ГСО рутина, анализ которого проводился в тех же усло­виях, что и проба водно-спиртового извлечения травы гречихи посевной (рис. 5Б).

В экспериментально подобранных условиях при температуре окружающей среды 20 °С, доминирующий пик (№2), соответствующий ГСО рутина, имеет время удерживания 2,4 мин (рис. 5).






А Б

Рис. 5. Хроматограмма анализа травы гречихи посевной: А - проба водно-спиртового извлечения травы гречихи посевной, Б - проба ГСО рутина

Особенностью данной методики является её универсальность и возможность приложения в анализе других препаратов, в составе которых имеются флавоноиды гречихи посевной.

Метрологические характеристики методики количественного определения ру­тина в траве гречихи методом ВЭЖХ представлены в таблице 5. Результаты ста­тисти­ческой обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения рутина в траве гречихи посевной с доверительной вероят­ностью 95% составляет ± 4,65 %.

Таблица 5

Метрологические характеристики методики ВЭЖХ-анализа

количественного определения рутина в траве гречихи посевной


f



S

P, %

t (P,f)

X

E, %

10

3,10

0,0646

95

2,23

0,144

± 4,65

Содержание рутина в траве гречихе посевной, культивируемой в Самарской области, находится в диапазоне 2,50-3,70 %.

  1. Исследования по разработке и стандартизации лекарственных препара­тов на основе гречихи посевной

На основании результатов настоящих исследований химического состава травы гречихи посевной, а именно высокого содержания БАС флавоноидной природы (рутин), было проведено исследование по разработке способа получения новых фла­воноидных препаратов «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой».

4.1. Стандартизация препаратов на основе травы гречихи посевной

При разработке методик качественного анализа и количественного определе­ния содержания флавоноидов в препаратах травы гречихи посевной мы придержи­вались принципа унификации методов анализа в ряду лекарственное растительное сырье – фитосубстанция – лекарственная форма (Самылина И.А. и др., 1994). За ос­нову взяты подходы к стандартизации, рекомендованные нами при разработке мето­дик качественного и количественного анализа травы гречихи посевной с использо­ванием ГСО рутина. Коррекции подвергались лишь размеры проб (навески) анали­зируемых объектов. Определение проводили в 11-ти повторениях, результаты ана­лиза подвергали статистической обработке.

Для качественной оценки препаратов нами предложено использовать комплексный подход, заключающийся в одновременном применении ТСХ-анализа (рис. 7) и спектрофотометрии.

Количественное содержание флавоноидов в препаратах гречихи посевной, как и в отношении сырья, определяли методом дифференциальной спектрофотометрии (рис. 8) с использованием ГСО рутина, что нашло отражение в проектах ФСП на жидкий и густой экстракты гречихи.

Содержание суммы флавоноидов в жидком и густом экстрактах гречихи посев­ной варьирует от 2,4 до 3,10 % и от 23,41 до 24,10 % соответственно в зависимости от места культивирования и года сбора исходного сырья.

Таблица 6



Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в препаратах

«Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой»

Наименование лекарственного препарата

f



S

P, %

t (P,f)

X

E, %

Гречихи экстракт жидкий

10

2,51

0,0425

95

2,23

0,095

± 3,78

Гречихи экстракт густой

10

23,90

0,5005

95

2,23

1,116

± 4,87

Помимо метода дифференциальной спектрофотометрии нами разработаны мето­дики количественного анализа рутина в препаратах гречихи методом ВЭЖХ.

При ВЭЖХ-анализе ЛП «Гречихи экстракта жидкого» и «Гречихи экстракта густого» считаем рациональным использовать раствор А из метода спектрофото­метрического анализа исследуемого препарата.


Таблица 7

Метрологические характеристики методики ВЭЖХ-анализа

количественного определения рутина в препаратах

«Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой»

Наименование лекарственного препарата

f



S

P, %

t (P,f)

X

E, %

Гречихи экстракт жидкий

10

1,84

0,0355

95

2,23

0,070

± 4,30

Гречихи экстракт густой

10

7,73

0,1716

95

2,23

0,383

± 4,95

Содержание рутина в препаратах «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экс­тракт густой» находится в диапазоне 1,50-2,10 % и 7,10-8,20 % соответственно.

Метрологические характеристики методики количественного определения ру­тина в жидком и густом экстракте гречихи посевной представлены в таблице 7.



4.2. Обоснование способа получения субстанции «Рутин» из травы гречихи посевной

Как указывалось выше, рутин является одним из ценнейших антиоксидантов, применяемых в медицине. В мировой практике его получают из сырья софоры японской, промышленная сырьевая база которого отсутствует в РФ. По этой при­чине до настоящего момента рутин поступает на отечественный фармацевтический рынок из-за рубежа.

Ранее был описан способ получения рутина из гречихи посевной, однако он имел низкий выход готового продукта и не нашел применения в промышленности.

В настоящей работе приведены результаты исследований по разработке техно­логии получения субстанции «Рутин» из травы гречихи посевной. Способ получе­ния рутина был разделён на несколько этапов: первый этап – получение техни­ческого рутина; второй этап – очистка целевого продукта путем перекристаллиза­ции. При этом получили субстанцию рутина с высокой степенью очистки. Выход рутина составил 1,5-2,0 % от массы воздушно-сухого сырья. Качество очистки ру­тина оценивают с помощью ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

Результаты сравнительных исследований показали, что образец рутина, полу­ченный из травы гречихи посевной, не уступает по показателям качества образцу рутина импортного производителя (Merck). Для получения стандартного образца рутина использовал рехроматографию на полиамиде с последующей перекристалли­зацией.

5. Обоснование целесообразности использования в медицинской практике нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» и лекарственных препаратов на основе данного сырья.

В результате проведенных исследований травы гречихи посевной выявлено высокое содержание флавоноидов (до 6,50 %) и доминирующего флавоноида – ру­тина (до 3,10%). Данное сырье может быть использовано как в качестве источника для получения импортозамещающих флавоноидных препаратов, так и в качестве отечественного источника рутина. В рамках обоснования целесообразности созда­ния лекарственных препаратов на основе травы гречихи посевной нами были разра­ботаны проекты ФСП на препараты «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экс­тракт густой».

Исследования по выявлению фармакологической активности полученного об­разца гречихи экстракта жидкого проводили на кафедре фармакологии им. заслу­женного деятеля науки РФ проф. А.А. Лебедева ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоц­развития России под руководством профессора А.В. Дубищева и профессора О.Л. Кулагина, при этом было выявлено гепатопротекторное действие и нейротропная активность.

Изучение гепатопротекторного действия жидкого экстракта гречихи, содержа­щего флавоноиды, проводили при токсическом поражении печени при применении парацетамола (опыт 1) и изониазида (опыт 2) в опытах in vivo. В процессе исследо­вания (опыт 1) было установлено, что в крови животных 2 группы в обоих опытах наблюдалось уменьшение уровня общего билирубина и АЛАТ, в гомогенате печени – увеличение активности каталазы и уменьшение количества малонового диальде­гида. В результате проведенных исследований нами были разработаны возможные пути преодоления гепатотоксического действия изониазида и парацетамола в опы­тах in vivo с применением экстракта гречихи жидкого.



Ноотропное действие экстракта гречихи жидкого изучали путем выработки ус­ловного рефлекса активного избегания (УРАИ), помещая животных в камеру с элек­трифицированным решетчатым полом на расположенную в центре безопасную площадку. В ходе эксперимента было установлено, что время поиска безопасной площадки при повторном воздействии тока сокращалось в 4 раза по сравнению с контролем при введении экстракта гречихи, а количество обученных крыс в иссле­дуемой группе составило 100% на второй день опыта. Результаты, полученные в ходе эксперимента, свидетельствуют о влиянии препарата на процессы запомина­ния, а также на концентрацию внимания при избегании электроболевого раздраже­ния, что доказывает ноотропное действие жидкого экстракта гречихи посевной.
ВЫВОДЫ

  1. В результате анатомо-морфологического исследования нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» выявлены морфолого-анатомические особенности строения данного сырья, которые положены в основу разделов «Внешние признаки» и «Микроскопия» проекта ФСП «Гречихи посевной трава».

  2. В ходе изучения химического состава гречихи посевной, культивируемой в Самарской области, выделены пять индивидуальных веществ: рутин, кверцетин, изокверцитрин (флавоноиды), хлорогеновая и кофейная кислоты (фенилпропаноиды), идентификация которых осуществлялась с помощью УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии, результатов химических превращений (кислотный и ферментативный гидролиз).

  3. Разработаны методики качественного анализа ЛРС «Гречихи посевной трава» и ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использова­нием ГСО рутина, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

  4. Разработаны методики количественного анализа ЛРС «Гречихи посевной трава» по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутин мето­дом дифференциальной спектрофотометрии и рутина методом хроматоспектро­фотометрии. Содержание суммы флавоноидов в гречихе по­севной варьирует от 5,30 до 6,10 % в зависимости от места культивирования и года сбора, содержание рутина находится в диапазоне 2,50-3,70 %.

  5. Изучена динамика накопления флавоноидов в траве гречихи, при этом выявлена оптимальная для сбора сырья фаза вегетации данного растения – фаза массового цветения – начала плодоношения.

  6. Обоснован способ получения субстанции «Рутин» из травы гречихи посевной, позволяющий получать целевое вещество с выходом 1,5-2,0 % от массы воздушно-сухого сырья.

  7. На основе результатов проведенных исследований предложены подходы к стандартизации сырья гречихи посевной, заключающиеся в использовании таких методов анализа, как тонкослойная хроматография, УФ-спектроскопия, дифференциальная спектрофотометрия, хроматоспектрофотометрия, ВЭЖХ с применением ГСО рутина в методиках анализа.

  8. Разработаны методики количественного анализа ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутин методом дифференциальной спектрофотометрии и рутина методом ВЭЖХ использованием ГСО рутина. Содержание суммы флавоноидов в жидком и густом экстрактах гречихи посевной варьирует от 2,4 до 3,10 % и от 23,41 до 24,10 % соответственно. Содержание рутина в препаратах «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой» находится в диапазоне 1,50-2,10 % и 7,10-8,20 % соответственно.

  9. Изучены показатели качества новых лекарственных препаратов «Гречихи экс­тракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина, ко­торые положены в основу соответствующих проектов ФС и на их основе раз­работаны проекты ФС «Гречихи посевной трава», ФСП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

  10. Выявлена гепатопротекторная и ноотропная активность ЛП «Гречихи экс­тракт жидкий». Обоснована целесообразность внедрения лекарственных пре­паратов на основе нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной – перспективный сырьевой источник ангиопротектор­ных препаратов / М.М. Анисимова // Известия Самарского научного центра РАН. – 2008. – Т. II. – С. 190-192.

  2. Куркин, В.А. Антиоксидантная активность суммарных извлечений травы гречихи посевной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин // Известия самарского научного центра РАН. – 2009. – Т. 11, № 1 (6). – С. 1259-1261.

  3. Куркин, В.А. Создание ресурсосберегающих технологий переработки лекарственного раститель­ного сырья / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, О.Е. Правдивцева, А.В. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Булан­кин, М.М. Анисимова, Л.Р. Сулейманова, Н.Р. Шагалиева, А.И. Хусаинова // Известия Самар­ского научного центра РАН. – 2010. – № 12, № 1 (3). – С. 737-740.

  4. Анисимова, М.М. Качественный и количественный анализ флавоноидов травы гречихи посев­ной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.Н. Ежков // Известия Самарского научного центра РАН. – 2010. – № 12 (33), № 1 (8). – С. 2011- 2014.

  5. Анисимова, М.М. Анатомо-морфологическое исследование травы гречихи посевной (Fagopy­rum sagittatum Gilib.) / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко // Медицин­ский альманах. – 2010. – № 3 (12).– С. 204-206.

  6. Анисимова, М.М. Методические и методологические аспекты стандартизации травы гречихи посевной / М.М. Анисимова // Аспирантский вестник Поволжья. – Самара, 2011. – Т. 1-2. – С. 177-179.

  7. Анисимова, М.М. Исследование возможности использования высокоэффективной жидкостной хроматографии для стандартизации сырья гречихи посевной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов // Известия Самарского научного центра РАН. – 2011. – № 13, № 1 (4). – С. 767-769.

  8. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной – перспективный источник рутина / М.М. Аниси­мова // Труды Х Всероссийского конгресса «Экология и здоровье человека». – Самара, 2005. – С. 17-18.

  9. Анисимова, М.М. Трава гречихи как потенциальный источник рутина / М.М. Анисимова // Аспи­рантские чтения Поволжья: сб. науч. тр. – Самара, 2007. – С. 184-191.

  10. Kurkin, V. A. The new methodological approaches to the standartization of the some medicinal plants containing the flavonouds and phenylpropanoids / E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina, M.V. Egorov, V.M. Ryzhov, O.V. Sharova, E.S. Artamonova, F.S. Sat­darova, A.V. Egorova, Mohammed Lamrini, L.N. Zimina, M.M. Anisimova, D.G. Bulankin, A.V. Smirnov // XXIVth International conference on Polyphenols Communications: Vol.1., Salamanca, 2008. – P. 185-186.

  11. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной – новый сырьевой источник ангиопротекторных и антиоксидантных лекарственных средств / М.М. Анисимова, В.А. Куркин // VIII Международ­ный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». М.: РУДН, 2009. – С. 9-12.

  12. Куркин, В.А. Лекарственные растения как источник импортзамещающих гепатопротекторных, антиоксидантных, иммуномодулирующих и нейротропных лекарственных средств / В.А. Кур­кин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, О.Е. Правдивцева, А.В. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Сте­няева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Буланкин, М.М. Анисимова // VIII Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использо­ва­ния». М.: РУДН, 2009. – С. 360-363.

  13. Анисимова, М.М. Фитохимический анализ травы гречихи посевной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин // VII Международный симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. Материалы докладов. 19-23 октября 2009 г. – Москва Институт физиоло­гии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 2009. – С. 18-19.

  14. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной – перспективный источник капиллярукрепляющих и антиоксидантных лекарственных средств/ М.М. Анисимова // XV Всероссийская научно-прак­тическая конференция «Молодые ученые в медицине»: тез. докл. – Казань, 2010. – С. 245.

  15. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной – новый сырьевой источник ангиопротекторных и антиоксидантных лекарственных средств/ М.М. Анисимова // 4-ая Всероссийская с междуна­родным участием научно-методическая конференция «Фармобразование-2010»: Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ, ч. II, научные основы создания новых лекарственных средств. – Воронеж, 2010. – С. 34-35.

  16. Куркин, В.А. Флавоноиды и фенилпропаноиды – перспективные антиоксиданты лекарствен­ных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, О.Е. Правдивцева, А.В. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Буланкин, М.М. Ани­симова, Л.Р. Сулейманова, Н.Р. Шагалиева, А.И. Хусаинова // Тезисы докладов VIII Меж­дуна­родной конференции «Биоантиоксидант». – М., 2010. – С.241-243.

  17. Анисимова, М.М. Качественный и количественный анализ флавоноидов травы гречихи посев­ной / М.М. Анисимова // Материалы докладов Всероссийской конференции «Молодые ученые – медицине» Аспирантские чтения. – Самара, 2010. – С. 219-222.

  18. Анисимова, М.М. Анатомо-диагностическое исследование травы гречихи посевной (Fagopyrum sagittatum Gilib.) / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко // II Российский фитотерапевтический съезд: сб. науч. тр. – М., 2010. – С. 94-97.

  19. Kurkin, V.A. The new metodological approaches to the standartization of the some medical plants containing the flavonoids/ E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina, M.V. Egorov, V.M. Ryzhov, D.G. Bulankin, M.M. Anisimova, A.V. Egorova, L.N. Zimina // Poly­phenols Communication. – Salamanca, 2010. – Р. 548-549.

  20. Куркин, В.А. Флавоноиды и фенилпропаноиды как биологически активные соединения лекарст­венных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, О.Е. Правдивцева, А.В. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Булан­кин, М.М. Анисимова, Л.Р. Сулейманова, Н.Р. Шагалиева, А.И. Хусаинова // Актуальные про­блемы химии природных соединений: сб. тез. конф. – Ташкент, 2010. – С. 8-9.

  21. Анисимова, М.М. Перспективы использования травы гречихи посевной как сырьевого источ­ника ангиопротекторных препаратов / М.М. Анисимова, В.А.Куркин // XVIII Российского на­ционального конгресса «Человек и лекарство»: тез. докл. – М., 2011. - С. 499-500.

  22. Анисимова, М.М. Разработка новых подходов к стандартизации перспективных лекарственных растений / М.М.Анисимова, Л.Н. Зимина, Л.Р. Сулейманова // «Гаммермановские чтения –2011»: сб. науч. тр. – С.-Пб., 2011. – С. 8-10.

  23. Корчагина, Д.В. Исследование нейротропной активности препаратов зверобоя пятнистого и гречихи посевной / Д.В. Корчагина, А.В. Дубищев, М.М. Анисимова, Л.Н. Зимина, М.С. Горемыкина // Всероссийская научно-практическая конференция, посвящен­ная 40-летию фармацевтического факультета Самарского государственного меди­цинского университета «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, иннова­ции, при­оритеты». – Самара, 2011. – С. 403-406.

  24. Кулагин, О.Л. Возможные пути преодоления гепатотоксического действия изониазида в опы­тах in vivo/ О.Л. Кулагин, А.А. Царева, Т.М. Кривошеева, Е.С. Чуманова, М.М. Анисимова// Там же. – Самара, 2011. – С. 406-408.

  25. Кулагин, О.Л. Гепатопротекторное действие препаратов растительного происхождения, содер-жа­щих флавоноиды, при токсическом поражении печени / О.Л. Кулагин, А.А. Царева, В.В. Кулаков, И.С. Муллова, М.М. Анисимова// Там же. – Самара, 2011. – С. 417-419.

  26. Удостоверение на рационализаторское предложение № 161 ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоц­развития России от 20.06.2011 «Способ получения жидкого экстракта гречихи посевной» / В.А. Куркин, М.М. Анисимова.

  27. Удостоверение на рационализаторское предложение № 162 ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоц­развития России от 20.06.2011 «Методика количественного определения рутина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)» / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов.

Подписано в печать.

Формат 60х84. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ___.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт».

443070, Самара, ул. Революционная, д. 70, литера П.



Тел. 372-06-56, 372-06-57.



База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка