Использование issr-анализа для изучения внутри- и межвидового генетического полиморфизма различных таксонов высших растений




Дата канвертавання25.04.2016
Памер183.48 Kb.
Использование ISSR-анализа для изучения внутри- и межвидового генетического полиморфизма различных таксонов высших растений.
Грушецкая З.Е., Никитинская Т.В., Кубрак С.В., Дзюбан О.В., Кухарева Л.В., Титок В.В., Лемеш В.А., Парфенов В.И., Хотылева Л.В.
Введение. Генетическое разнообразие популяции определяет её способность адаптироваться к непосредственному окружению в процессе естественного отбора. При низких показателях внутрипопуляционного полиморфизма снижается количество возможных комбинаций генов, способствующих адаптации к окружающей среде, что уменьшает вероятность того, что в этой популяции возникнут новые приспособленные генотипы. Таким образом, популяция в естественных условиях нуждается в соответствующем уровне генетического разнообразия для выживания под давлением постоянно меняющихся биотических и абиотических компонентов экосистемы. В процессе искусственного отбора сельскохозяйственных культур наблюдаются закономерности, аналогичные происходящим в естественных популяциях. Среди генетически полиморфных образцов селекционных популяций выделяются индивидуальные генотипы, обладающие признаками, которые позволяют данной сельскохозяйственной культуре выживать в условиях запрограммированной окружающей среды или успешно противостоять вредителям и возбудителям заболеваний. Поэтому при разработке эффективных селекционных программ необходимы источники генетического разнообразия.

Уровень генетического полиморфизма как природных популяций, так и культурных растений наиболее эффективно определяется с помощью ДНК-маркеров. Помимо оценки биоразнообразия, молекулярные маркеры применяются для исследования происхождения, доместикации видов и их последующей миграции, получения информации по филогенетическим взаимоотношениям между видами, а также для географической локализации популяций, имеющих разное генетическое происхождение [19].

Для изучения связей между таксонами растений часто используется анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей уникальных генов, таких как рибосомальные транскрибируемые спейсеры ITS-1 и ITS-2, (Крюков А.А., Гельтман Д.В., Мачс Э.М., Родионов А.В. Филогения видов подрода Esula рода Euphorbia (Euphorbiaceae) по результатам сравнительного анализа последовательностей района ITS1-5.8S рДНК-ITS2 // Ботанический журн. 2010. Т. 95. 6. С. 801-819.) спейсеры хлоропластного генома (Носов) и т.д. Однако, эти данные не всегда можно экстраполировать на эволюцию генома в целом, поскольку различные локусы генома эволюционируют с разной скоростью. Применение нейтральных молекулярных маркеров, таких как ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat), сравнительно равномерно распределенных по растительному геному, позволяет одновременно определить изменчивость по группе не связанных между собой локусов, что особенно ценно для сохранения и использования генетических ресурсов. Такая информация дает возможность оценить генетический дрейф, происходящий в экосистемах, а также эффективно проводить мониторинг популяций редких и исчезающих видов растений, находящихся на охраняемых территориях.

Для создания ISSR-маркеров используют праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов (так называемый "якорь"). Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты уникальной ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными последовательностями. В результате амплифицируется большое число фрагментов, представленных на электрофореграмме дискретными полосами (ISSR-фингерпринтинг). Полученные ПЦР-продукты относятся к маркерам доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию/отсутствию полосы. Для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. Метод обладает хорошей воспроизводимостью и может быть с успехом использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации групп растений различного таксономического ранга, а в ряде случаев и для индивидуального генотипирования [38, 39].

В связи с тем, что существует много противоречивых данных об отличии различных типов ДНК-маркеров и возможности их применения для анализа таксонов различного уровня (29 ФАО), целью данного исследования является анализ информативности ISSR-маркеров при исследовании внутри- и межвидового генетического полиморфизма культурных и дикорастущих растений –Linum ussitatissimum L., Trollius europaeus L., Salvia sclarea L., Calluna vulgaris L. и Polypodium vulgare L.

Материал и методы. Материалом для исследования послужили 17 популяций 4 дикорастущих видов (Calluna vulgaris L., Salvia sclarea L., Polypodium vulgare L., Trollius europaeus L.) и 18 сортов, относящихся к различным подвидам Linum usitatissimum L. (таблица 1). Образцы Calluna vulgaris L., Salvia sclarea L., и Trollius europaeus L. находятся в коллекции Центрального ботанического сада НАН Беларуси, сорта Linum usitatissimum – Института генетики и цитологии НАН Беларуси, образцы Polypodium vulgare собраны авторами в различных эколого-географических местообитаниях. Характеристика образцов коллекции и присвоенные им каталожные номера представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Характеристика коллекции видов растений




Кат. №

Видовая принадлежность

Характеристика образца

Cv1

Calluna vulgaris L. – Вереск обыкновенный

Дикорастущая форма

Cv2

Популяция, полученная отбором из Cv1

Cv3

Популяция, полученная отбором из Cv1

Ss1

Salvia sclarea L. – Шалфей мускатный

Популяция, полученная отбором из дикорастущего вида

Ss2

Популяция, полученная отбором из дикорастущего вида

Ss3

Популяция, полученная отбором из дикорастущего вида

Pv1

Polypodium vulgare L. Многоножка обыкновенная

Место сбора - Россия, Кавказ (Краснодарский край, окр. д. Пшада)

Pv2

Место сбора - РБ, Минская обл., Воложинский р-н, окр. д. Юржишки,

Pv3

Место сбора - РБ, Брестская обл., окр. д. Орехово,

Pv4

Место сбора - Минск, ЦБС

Pv5

Место сбора - Минск, ботаническая площадка редких растений БГУ

Te1

Trollius europaeus L. – Купальница европейская

Дикорастущая форма

Te2

Популяция, полученная отбором из Te1

Te3

Популяция, полученная отбором из Te1

Te4

Популяция, полученная отбором из Te1

Te5

Популяция, полученная отбором из Te1

Te6

Популяция, полученная отбором из Te1

Lu1

Linum ussitatissimum L. subsp. elongatum Vav. et Ell.– Лен обыкновенный, подвид долгунец

Оршанский 2

Lu2

Блакит

Lu3

А-29

Lu4

Славный 82

Lu5

Linum ussitatissimum L. subsp. usitatissimum convar. intermedium Czernom.– Лен культурный, лен-межеумок

Koto

Lu6

Leona

Lu7

Norlin

Lu8

Culbert

Lu9

Linum ussitatissimum L. subsp. usitatissimum convar. humile Czernom.– Лен культурный, лен-кудряш

Lirina

Lu10

Flanders

Lu11

Raluca

Lu12

Linum ussitatissimum L. subsp. mediterraneum Vav. et Еll.– Лен культурный, лен крупносемянный

Ocean

Lu13

Maritime

Lu14

Endress Olajlen

Lu15

Linum ussitatissimum L. subsp. crepitans Boenn. – Лен культурный, лен растрескивающийся

Grandal

Lu16

Dehiscent

Lu17

Mourisco E730


Выделение ДНК. Выделение геномной ДНК проводили согласно методике, описанной Plaschke [10]. Для выделения использовали 100-200 мг растительной ткани, объем выборки – 10-15 индивидуальных растений.

Методика ISSR-анализа. Для анализа всех образцов коллекции использовали общий набор из 5 3'-заякоренных ISSR-праймеров, максимально информативных по результатам предварительных исследований (ОДО «Праймтех», табл. 2). ПЦР-реакция проводилась по следующей схеме: реакционная смесь включала от 50 до 100 нг геномной ДНК, 0,5 mM праймера, 0,2 mМ каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2 мМ МgCl2 и 1 единицу Taq-полимеразы в инкубационном буфере. Условия проведения реакции были адаптированы для каждого вида растений. Нуклеотидная последовательность использованных праймеров и температура отжига представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Характеристика ISSR-праймеров

Название

праймера


Нуклеотидная последовательность

праймера (5’-3’)



Температура отжига, 0С

L. ussitatissimum

P. vulgare

T. europaeus

S. sclarea

C. vulgaris

ISSR-09

(atg)6

50,0

52,0

56,0

51,2

54,8

ISSR-10

(gaa)6

55,0

57,0

56,0

54,7

49,2

ISSR-17

(gaca)4

54,3

58,3

48,5

56,0

54,3

ISSR-22

(ac)8aa

54,3

52,0

54,7

55,6

55,2

ISSR-23

(ac)8ta

49,0

54,0

51,2

55,6

54,3

Условия проведения реакции: денатурация - 5 мин при 940С; циклы 2 – 35: 30 сек. при 940 С, 45 сек. при 49-600С в зависимости от праймера и исследуемого вида растений, и 2 мин при 720С; цикл 36 – 10 мин при 720С.

Продукты ISSR-анализа разделялись в 1,5% агарозном геле и визуализировались окрашиванием бромистым этидием.

Статистический анализ данных. По результатам ISSR-анализа была составлена бинарная матрица данных. Присутствие или отсутствие каждого амплификационного фрагмента обозначалось соответственно как 1 и 0.

Оценка генетических дистанций между образцами коллекций видов растений на основании данных о расщеплении по локусам, полученным в результате ISSR-анализа, проводилась по методу Нея и Ли [225]. Расчет дистанций и построение дендрограммы, отражающей филогенетические связи между образцами, проводилось при помощи программы TREECON for Windows v.1.3b [227].



Результаты и обсуждение

Сравнительное изучение полногеномных нуклеотидных последовательностей растений показало, что на 90% растительные геномы состоят из повторяющихся последовательностей ДНК, или микросателлитов. У растений наиболее обычными повторами являются мотивы (А)n, (АТ)n или (GA)n, где n колеблется между 10 и 80 [1,2]. В растительных геномах наиболее часто встречаются тринуклотидные повторы, (TNR), затем ди- (DNRs) и тетрануклеотидные (TTNRs)[3]. Вследствие накопления подобных данных маркеры, основанные на полиморфизме микросателлитных последовательностей, стали наиболее широко использоваться для фингерпринтинга генотипов (20). Для сравнительного анализа полиморфизма растений, принадлежащих различным систематическим группам, были подобраны ISSR-маркеры, высокополиморфные по результатам предварительных исследований (ссылка Света). В таблице 2 представлена сравнительная информативность ISSR-маркеров при анализе растений, принадлежащих различным семействам:



Таблица 2 - Информативность ISSR-маркеров при анализе генетического полиморфизма различных видов растений.




Вид растения

Характеристика ISSR-маркеров

ISSR-09

ISSR-10

ISSR-17

ISSR-22

ISSR-23

Общее количество амплифицированных фрагментов, шт

Уровень полиморфизма, %

Общее количество амплифицированных фрагментов, шт

Уровень полиморфизма, %

Общее количество амплифицированных фрагментов, шт

Уровень полиморфизма, %

Общее количество амплифицированных фрагментов, шт

Уровень полиморфизма, %

Общее количество амплифицированных фрагментов, шт

Уровень полиморфизма, %

1

Linum usitatissimum

8

0,0

14

28,6

17

82,4

15

73,3

17

100,0

2

Salvia sclarea

11

54,5

11

27,2

10

10,0

8

0,0

1

0,0

3

Trollius europaeus

5

80,0

7

14,2

8

62,5

5

60,0

14

78,6

4

Polypodium vulgare

7

85,7

4

75,0

9

77,8

5

80,0

3

70,0

5

Calluna vulgaris

8

87,5

18

88,8

19

68,4

15

60,0

9

88,8

Полученные данные свидетельствуют о совершенно различном характере представленности микросателлитных повторов у представителей различных семейств высших растений. Так, тринуклеотидный повтор ATG, высокополиморфный для всех проанализированных видов, был совершенно неинформативен для подвидов Linum usitatissimum, что могло бы свидетельствовать о сужении генетического разнообразия в результате искусственного отбора, однако ди- и тетрануклеотидные повторы в геноме льна представлены широко и полиморфны на 73,3–100%. С другой стороны, для шалфея мускатного, представителя семейства Яснотковые, динуклеотидные повторы AC слабо представлены в геноме, и совершенно неполиморфны, и наибольшей информативностью обладают повторы тринуклеотидные (27,2–54,5%). Интересно, что геном многоножки обыкновенной, относящейся к высшим споровым растениям (отд. Polypodióphyta), также был высокополиморфен по данным ISSR-маркерам, хотя общее количество ПЦР-продуктов, полученных в результате амплификации, было сравнительно невелико – 3-9 в зависимости от праймера. По ряду микросателлитных маркеров, высокоинформативных для прочих представленных видов (ISSR-04, ISSR-08, ISSR-09a, ISSR-24), амплификация с ДНК Polypodium vulgare отсутствовала, что может косвенно свидетельствовать о низкой представленности соответствующих микросателлитных повторов в геноме данного таксона.



Внутривидовая неоднородность среди анализируемых видов, а также подвидов Linum usitatissimum, выявляемая с помощью ISSR-маркеров, отражена в таблице 3. В ней представлены средние генетические дистанции между генотипами внутри вида/подвида, и генетические дистанции между проанализированными видами.
Таблица 3 – Средние генетические дистанции между различными таксонами растений.




C. vulgaris

S. sclarea

T. europaeus

P. vulgare

L. usitatissimum

subsp. elongatum

subsp. usitatissimum convar. intermedium

subsp. usitatissimum convar. humile

subsp. mediterraneum

subsp. crepitans

C. vulgaris

0,27

0,46

0,50

0,37

0,39

0,41

0,40

0,40

0,42

S. sclarea




0,06

0,63

0,44

0,48

0,49

0,47

0,46

0,42

T. europaeus







0,08

0,48

0,49

0,49

0,49

0,47

0,46

P. vulgare










0,11

0,33

0,34

0,32

0,33

0,32

L. usitatissimum

subsp. elongatum













0,05

0,05

0,07

0,13

0,14

subsp. usitatissimum convar. intermedium
















0,06

0,07

0,14

0,13

subsp. usitatissimum convar. humile



















0,08

0,12

0,14

subsp. mediterraneum






















0,10

0,13

subsp. crepitans

























00,08

Сравнительно низкий уровень полиморфизма внутри подвидов elongatum и usitatissimum convar. intermedium льна культурного (0,05 и 0,06 соответственно) отражает сужение генетического разнообразия, возникшее в результате искусственного отбора. Данные подвиды наиболее часто вовлекались в селекцию льна-долгунца, что привело к обеднению генофонда и генетической эррозии сортов. Подвиды льна subsp. usitatissimum convar. humile, subsp. mediterraneum и subsp. сrepitans в селекцию практически не вовлекались, и уровень их полиморфизма обусловлен естественной изменчивостью генома L. usitatissimum (0,08-0,1).

Для дикорастущих видов S. sclarea и T. europaeus также отмечен невысокий уровень внутривидовой изменчивости – средние генетические дистанции между проанализированными популяциями составляли 0,06 и 0,08 соответственно. Однако в данном случае речь идет не о внутривидовом, а о внутрипопуляционном полиморфизме, поскольку все проанализированные генотипы по сути представляют собой отбор из одной дикорастущей популяции, выращиваемой в различных экологических условиях. Для многоножки обыкновенной и вереска обыкновенного значения генетических дистанций между популяциями выше, и соответствуют ожидаемым для данных видов. (Genetica. 2005 Nov;125(2-3):283-291. Four tropical, closely related fern species belonging to the genus Adiantum L. are genetically distinct as revealed by ISSR fingerprinting. Korpelainen H, de Britto J, Doublet J, Pravin S.), T., Borchert; A., Hohe Identification of molecular markers for the flower type in the ornamental crop Calluna vulgaris Euphytica , Volume 170 (1) , 2009 p203-213)

На основании кластерного анализа генетических дистанций между популяциями построена дендрограмма (Рисунок 1). Топология дендрограммы соответствует основным представлениям о филогенетических взаимоотношениях между исследованными видами (ссылка).



Рисунок 1. Кластерный анализ генетических дистанций между образцами Calluna vulgaris (популяции Cv1-Cv3), Trollius europaeus (Te1-Te6), Linum usitatissimum (Lu1-Lu17), Salvia sclarea (Ss1-Ss3), Polypodium vulgare (Pv1-Pv5).
Заключение. Анализ информативности ISSR-маркеров, полученных на коллекции видов Linum ussitatissimum L., Trollius europaeus L., Salvia sclarea L., Calluna vulgaris L. и Polypodium vulgare L. показал, что данный тип маркеров применим при исследовании как внутривидового, так и межвидового генетического полиморфизма культурных и дикорастущих растений. Анализ внутривидовой неоднородности, значения генетических дистанций между популяциями в значительной степени определяются характером микросателлитных повторов и их представленностью в геномах исследуемых видов, поэтому обязательным требованием при изучении генетического полиморфизма различных таксонов является скрининг информативности ISSR-маркеров.

Применение нейтральных молекулярных маркеров, таких как ISSR, сравнительно равномерно распределенных по растительному геному, позволяет одновременно определить изменчивость по группе не связанных между собой локусов, что особенно ценно для сохранения и использования генетических ресурсов.


База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка