Фатыхова диана газинуровна антимутагенный потенциал биокомплексов растительного и животного происхождения в микробных тест-системах




старонка1/4
Дата канвертавання27.04.2016
Памер0.49 Mb.
  1   2   3   4


ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

ФАТЫХОВА ДИАНА ГАЗИНУРОВНА



АНТИМУТАГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ БИОКОМПЛЕКСОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В МИКРОБНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ

03.02.03 – микробиология


АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2012

Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».


Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

академик АН РТ

Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, профессор



Госманов Рауис Госманович
Кандидат биологических наук, доцент

Кипенская Лариса Викторовна

Ведущая организация: Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа


Защита диссертации состоится «22» февраля 2012 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.

Факс 8(843)238-71-21, 233-78-40. E-mail: fadi@bk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского федерального университета


Автореферат разослан «_____» января 2012 г.


Ученый секретарь З. И. Абрамова

диссертационного совета,

доктор биологических наук






Актуальность. В настоящее время в биосфере идёт прогрессивное накопление химических соединений антропогенного происхождения, многие из которых обладают мутагенными свойствами. Известно, что химические вещества могут индуцировать генные, хромосомные и геномные мутации, обладая высокой специфичностью действия [Болтина, 2009]. Поэтому поиск антимутагенов – веществ, защищающих генетический аппарат соматических и половых клеток человека от повреждения – является необходимым. Открытие новых веществ, снижающих частоту индуцированных мутаций, быстро растёт, и к настоящему времени насчитывается более 300 природных и синтетических антимутагенных соединений: витаминов, аминокислот, естественных метаболитов, пищевых добавок, лекарств и некоторых других соединений органической и неорганической природы [Бентхен, 1986; Arriaga-Alba, 2000].

Особую актуальность и значимость приобретает проведение профилактики мутагенеза на основе применения природных соединений растительного и животного происхождения. В последние годы возрос интерес к исследованию антимутагенной активности растительных и животных компонентов в свете возможности использования их для профилактики и лечения онкологических, а также ряда других заболеваний, сопровождающихся повышенной чувствительностью генома к повреждениям. Растения являются источниками разнообразных биоактивных соединений (витамины, полисахариды, гликопептиды, аминокислоты, сульфиды, сапонины, полифенолы, терпеноиды, изофлавоны, индолы и др.), обладающих антиоксидантными, антимутагенными, антиканцерогенными и иммуномодулирующими свойствами [Santos-Cervantes et al., 2007]. Перспективность использования растительных препаратов в медицине обусловлена также возможной минимизацией их токсических эффектов в млекопитающих, что объясняется сходным химическим составом биологически активных веществ живых организмов, а также определенным сродством метаболизма растительной и животной клетки [Коломиец, Ефимов, 2005]. Биокомплексы животного происхождения также обладают антиоксидантной и иммуностимулирующей активностью, проявляют антисептическое действие и используются в качестве лекарственных средств и биологически активных комплексов. Пчелиная перга обладает выраженными антитоксическими свойствами, способствует повышению содержания в крови эритроцитов, ретикулоцитов и гемоглобина, обеспечивает нормализацию количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы [Хисматуллина, 2005]. Роговое вещество копытных животных издавна является привлекательным материалом как источник биологически активных веществ. Экстракты из рогов сайгака используют для лечения нервных заболеваний, а также как жаропонижающее и гипотензивное средства [Романов, 2005; Романов, Лебедева, 2003]. Однако природа и спектр биологической активности препаратов растительного и животного происхождения изучены недостаточно.

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явился сравнительный анализ антимутагенных свойств биокомплексов, полученных из пчел, парнокопытных млекопитающих и растений для оценки потенциала их практического использования.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1.Определить токсические, генотоксические и антимутагенные эффекты биокомплекса пчелиной перги в бактериальных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест).

2.Выявить токсические свойства лекарственных соков и экстрактов растений (Plantago major, Tussilago farfara, Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia, Panax japonicus, Hyssopus officinalis) по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям.

3.Установить возможность модуляции уровня индуцированных мутаций различными растительными соками и экстрактами (Aloe arborescens, Callisia fragrans, Chelidonium majus, Plantago major, Aegopodium podagraria, Tussilago farfara, Dioscorea deltoidea, Polyscias fruticosa, Polyscias filicifolia, Panax japonicus).

4.Охарактеризовать антимутагенные свойства экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L. до и после периода гона животных.

5.Проанализировать антимутагенные эффекты и оценить потенциал практического использования биокомплексов, полученных из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих.

Научная новизна. Впервые установлены десмутагенные, биоантимутагенные и биостимулирующие эффекты биокомплекса пчелиной перги для исследуемых концентраций 1, 10 и 100 мкг/мл в бактериальных тест-системах на штаммах Salmonella typhimurium TA100 и Escherichia coli PQ37. Для исследуемых соков и экстрактов растений Callisia fragrans, Tussilago farfara, Chelidonium majus, Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Panax japonicus впервые получены данные об антимутагенных свойствах, выявленных в различных микробных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест, Rec тест). Впервые получены свидетельства о наличии десмутагенных эффектов у экстракта рогов сайгака возрастом 19 месяцев до периода гона в отношении известных мутагенов N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина (МННГ) и N4-аминоцитидина (Ац) в тесте Эймса на штамме Salmonella typhimurium TA100. В данной работе исследуемые биокомплексы растительного и животного происхождения впервые предложены к разработке как антимутагенные препараты.

Практическая значимость. Основным практическим достижением настоящей работы является обнаружение и характеристика антимутагенных эффектов биокомплексов, полученных из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих. Установленные результаты в совокупности с данными, свидетельствующими об отсутствии у исследованных биокомплексов токсических и мутагенных свойств, открывают очевидную перспективу их использования для профилактики индуцированного мутагенеза у человека. Таким образом, биокомплексы растительного и животного происхождения могут быть рекомендованы к разработке как антимутагенные препараты. Учитывая полученные нами данные уже существующие лекарства и биологически активные добавки, содержащие в своем составе биокомплексы, полученные из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих, также могут рассматриваться в качестве антигенотоксических и генопротекторных препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Биокомплекс пчелиной перги обладает десмутагенными, биоантимутагенными и биостимулирующими свойствами, снижая частоту индуцированных мутаций на 78%.

2.Из десяти исследуемых растений наибольшей антимутагенной активностью обладали соки Callisia fragrans, Chelidonium majus, Tussilago farfara и экстракты Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia, Panax japonicus. Максимальная антимутагенность продемонстрирована для сока чистотела большого (снижение частоты мутаций до 88%).

3.Среди экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L., исследуемых в возрасте животных от 19 до 43 месяцев, десмутагенную активность в отношении аналогов азотистых оснований проявил экстракт рогов 19-месячного сайгака до периода гона, уменьшающий мутагенный эффект на 31%.

4.Биокомплексы растительного и животного происхождения являются перспективной основой для разработки антимутагенных препаратов, эффективность которых зависит от физиологических и биохимических характеристик биообъекта.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ, регистрационный номер 01200955076, «Механизмы регуляции функциональной активности клеток» при поддержке АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (2.1.1/920), государственного контракта №02.740.11.0391, совместного гранта Министерства образования и науки Российской Федерации. Биохимический анализ биокомплекса пчелиной перги проводили на базе института фармакологической аналитики г. Бремен, Германия. Биохимический анализ биокомплекса экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L. проводили на базе Калмыцкого государственного университета, г. Элиста. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.



Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 79-ой всероссийской студенческой конференции, (Казань, 2005), ХLIII Международной научной студенческой конференции “Студент и научно-технический прогресс” (Новосибирск, 2005), итоговой конференции КГУ (Казань, 2006), II-ой Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), Международной конференции "Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD" (Казань,2009), научной школе-конференции ХIII симпозиума студентов и аспирантов - биологов Европы «SymBioSE - 2009» (Казань, 2009), Международной научно-практической конференции "Научное обеспечение устойчивого ведения сельскохозяйственного производства в условиях глобального изменения климата" (Казань,2010), III Всероссийского конгресса с международным участием студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия" (Нижний Новгород, 2010), Всероссийской научно-практической конференции "Инновационные разработки молодых ученых - АПК России" (Казань,2010), а также на Первой Всероссийской молодёжной научной конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии" (Томск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 2 статьи в центральных отечественных рецензируемых журналах: Экологическая генетика; Ученые записки Казанского университета. Секция Естественные науки.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 28 рисунков. Библиография содержит 133 наименований, в т.ч. 57 - зарубежных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ


    1. Тестерные штаммы

Бактериальные штаммы, использованные в работе, перечислены в таблице 1.

Таблица 1.

Тестерные штаммы бактерий



Штамм

Генотип

Источник

1

Salmonella typhimurium

TA 100


his G46, rfa, uvr, bio, pkm 101

НИИ по БИХС

г. Купавна



2

Escherichia coli PQ37

sfi A: :mud (Ap lac) cts, lac A U169, mal+, uvr A, gal Y, pho C, rfa

Институт общей генетики, г. Москва

3.

Micrococcus luteus

дикий тип

Коллекция кафедры микробиологии КГУ

4.

Escherichia сoli WP2

trpE65

НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь

5.

Escherichia сoli polA

trpE65, sul, malB, polA

НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь

6.

Escherichia сoli uvrA

trpE65, sul, uvrA155

НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь

7.

Escherichia сoli recA

trpE65, recA

НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь


    1. Биологические объекты

      1. Растительный материал. В работе использованы соки лекарственных растений алоэ древовидного (Aloe arborescens), золотого уса (Callisia fragrans), чистотела большого (Chelidonium majus), подорожника большого (Plantago major), мать-и-мачехи обыкновенной (Tussilago farfara), сныти обыкновенной (Aegopodium podagraria) и экстракты диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea), полисциаса кустарникого (Polyscias fruticosa), полисциаса папоротниколистного (Polyscias filicifolia), женьшеня японского (Panax japonicus), любезно предоставленные доцентом кафедры физиологии и биотехнологии растений Казанского государственного университета Абдрахимовой Й.Р. Перед исследованием соки растений разводили стерильной дистиллированной водой до концентрации l:10 и 1:100. Экстракты исследуемых растений разводили в стерильной дистиллированной воде до концентраций 1; 0.1 и 0.01 мг/мл.

      2. Экстракты рогов сайгака Saiga tatarica L. В работе использовали экстракты, полученные из рогов сайгаков, любезно предоставленные Романовым Олегом Ермолаевичем, к.х.н., доцентом кафедры химии Калмыцкого госуниверситета. Оценивали антимутагенную активность следующих биокомплексов животного происхождения: 1.7ДГВ – экстракт верхней трети рогов сайгака, отобранных у животных возрастом 1 год и 7 месяцев до гона; 3.7ДГВ ˗ экстракт верхней трети рогов сайгака, отобранных у животных возрастом 3 год и 7 месяцев до гона; 1.7ПГВ - экстракт верхней трети рогов сайгака, отобранных у животных возрастом 1 год и 7 месяцев после гона.

      3. Приготовление образцов пчелиной перги. Образцы биокомплекса пчелиной перги были любезно предоставлены ООО "АНТ". Образцы разводили в стерильной дистиллированной воде. В работе были исследованы следующие концентрации 1; 10; 100; 1000 мкг/мл.

    2. Бактериальные тест-системы для определения токсических и мутагенных эффектов соединений природного происхождения

      1. Тест на токсичность по отношению к грамотрицательным и грамположительным микроорганизмам. О силе токсического действия исследуемых биокомплексов судили по выживаемости тестерных штаммов. В тесте использовали штамм Salmonella typhimurium TA100 и Micrococcus luteus. Согласно рекомендациям по проведению теста Эймса максимальная доза исследуемых соединений не должна подавлять рост тестерных бактерий более чем на 50% [Дурнев с соавт., 2003].

      2. Полуколичественный метод учета генных мутаций (тест Эймса). Мутагенную активность учитывали по кратности превышения числа индуцированных ревертантов над спонтанным фоном мутирования [Maron, Ames, 1983]. Для исключения артефактов в тесте Эймса в образцах определяли количественное содержание гистидина по методу, разработанному Ильинской и др. [Ильинская с соавт., 2001].

      3. SOS-хромотест. Проведение эксперимента и приготовление сред вели по методике, описанной в работе Миллера [Миллер, 1976] и Килардье [Quillardet et al., 1982]. Фактор индукции SOS–ответа (IF) исследуемого вещества определяли по соотношению активности конститутивной щелочной фосфатазы и индуцибельной β-галактозидазы. Если IF < 2 - вещество негенотоксично, IF > 2 – вещество генотоксично [Mersch-Sundermann et al., 1991; Bouhlel et al., 2007].

    3. Бактериальные тест-системы для определения антимутагенных эффектов соединений природного происхождения

1.4.1. Модификации теста Эймса. Для изучения антимутагенных свойств соединений растительного и животного происхождения использовали модификации теста Эймса: 1. Тестерные бактерии предварительно инкубировали с разными концентрациями биокомплексов в течение 2 часов, а затем в верхний агар добавляли один из мутагенов для оценки биоантимутагенного эффекта. 2. Исследуемые концентрации биокомплексов и один из мутагенов добавляли непосредственно в верхний агар без предварительной инкубации с тестерным штаммом для оценки возможных десмутагенных свойств. Антимутагенный эффект исследуемого соединения оценивали, сравнивая число колоний прототрофов, индуцированных мутагеном без обработки клеток раствором исследуемых соединений, и после преинкубации клеток с раствором и мутагеном. Cогласно Negi [Negi et al., 2003] ингибирование мутагенного эффекта менее чем на 25% свидетельствует о слабой, от 25% до 40% о средней, выше 40% - о сильном антимутагеном эффекте.

1.4.2. Модификации SOS-хромотеста. 1. Клетки E. coli PQ37 были обработаны исследуемыми биокомплексами в течение 2 часов с последующим добавлением мутагена для исследования на биоантимутагенную активность. 2. Исследуемые биокомплексы и мутаген были одновременно добавлены к культуре клеток E. coli PQ37. Антигенотоксический эффект растительных соков в SOS-хромотесте оценивали согласно формуле [Bouhlel et al., 2007]: сравнивали фактор индукции SOS-ответа в присутствии мутагена и исследуемых образцов, и фактор индукции SOS-ответа при действии только мутагена.

1.4.3. Rec тест. На чашки Петри с полноценной агаризованной средой засевали газоном культуры тестерных бактерий. В середину чашки на поверхность газона помещали стерильный бумажный диск (d = 2 см). Для оценки десмутагенного действия на диски одновременно наносили мутаген и исследуемые образцы в различных разведениях. Чашки Петри инкубировали 24 часа при температуре 37ºС. Антигенотоксический эффект оценивали, сравнивая размеры зон ингибирования роста штамма вокруг диска при совместном действии мутагена и исследуемых биокомплексов и при действии только мутагена.



    1. Статистический анализ данных

Статистическую обработку результатов проводили в стандартной компьютерной программе Microsoft Office Excel 2007. Данные представлены в виде среднего значения,  среднеквадратическое отклонение. Для оценки достоверности различий между результатами в вариантах опыта использовали t-критерий Стьюдента для множественных сравнений. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез был принят за р ≤ 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Антимутагенные эффекты биокомплекса, полученного из пчел

Перед исследованием антимутагенных свойств биокомплексов растительного и животного происхождения нами была проведена оценка токсического эффекта образцов биокомплексов в отношении тестерных бактерий, а также генотоксического потенциала образцов в бактериальных тест-системах.



2.1.1. Токсический эффект пчелиной перги по отношению к тестерному штамму Salmonella typhimurium TA100

Во всех исследованных концентрациях процент выживаемости тестерного штамма составил более 100% (табл.2). Полученные данные свидетельствуют о том, что биокомплекс, полученный из пчел, не только не проявил токсических эффектов на штамме S. typhimurium TA100 в исследованном спектре концентраций, но и стимулировал рост бактерий.

Таблица 2.

Влияние пчелиной перги на рост штамма S. typhimurium TA100




Концентрация пчелиной перги, мкг/мл

1

10

100

1000

Контроль

Количество КОЕ на чашку

40±2

44±3

41±1

43±5

39±6

Выживаемость,%

102

113

105

110

100



2.1.2. Мутагенные и генотоксические эффекты биокомплекса пчелиной перги в тесте Эймса и SOS-хромотесте

При исследовании пчелиной перги в тесте Эймса было показано, что число индуцируемых пчелиной пергой в концентрациях 1, 10, 100, мкг/мл His+ревертантов, не превышало спонтанный фон мутирования (рис.1). Так как число колоний-ревертантов в опыте и контроле различаются менее чем в 2.5 раза, то можно считать, что исследованные образцы перги не обладают мутагенной активностью в тесте Эймса. В SOS-хромотесте пчелиная перга ни в одной из исследуемых концентраций не проявила активности и не индуцировала значительный SOS-ответ в клетках тестерного штамма E. coli PQ37, что указывает на отсутствие генотоксических свойств исследуемого биокомплекса животного происхождения (рис.2).

Таким образом, на основании результатов, полученных в различных бактериальных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест), исследованный биокомплекс пчелиной перги можно охарактеризовать как нетоксичный и немутагенный в широком диапазоне концентраций (1-100 мкг/мл).


Рис 1. Оценка мутагенного эффекта пчелиной перги в тесте Эймса. ПК - позитивный контроль (N-Метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин - МННГ, 50 мкг/мл), НК – негативный контроль (спонтанный фон ревертантов), на данном и последующих рисунках: * - достоверно отличается от позитивного контроля, p≤0.05.




Рис.2. SOS-индуцирующий потенциал пчелиной перги. ПК - позитивный контроль: митомицин C (МС) – 100 мкг/мл, НК (пунктирная линия) - негативный контроль (спонтанный фон индукции SOS-ответа).

  1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©shkola.of.by 2016
звярнуцца да адміністрацыі

    Галоўная старонка